Geïnduceerde pluropotente stamcel-afgeleide motorneuronen van CMT type 2 onthullen mitochandriale disfunctie

Inleiding

WAAROM: De ziekte van Charcot-Marie-Tooth (CMT) is een erfelijke aandoening die geleidelijk de motorische en gevoelsfuncties van het perifeer zenuwstelsel aantast. Dit veroorzaakt zwakte en het wegkwijnen van spieren in de onderste ledematen, wat vervolgens leidt tot misvormingen van handen en voeten. De ernst van deze aandoening varieert; het komt voor bij zowel kinderen als volwassenen, en het treft 1 op 2500 personen. Het laboratorium van prof. Vincent Timmerman tracht een antwoord te vinden op de complexiteit van CMT, want CMT komt in meerdere types en subtypes voor. Deze complexiteit bemoeilijkt het zoeken naar een behandeling voor de meeste CMT- subtypes.

WAT: Jonas Van lent, doctoraatsstudent, publiceerde deze zomer zijn eerste onderzoeksresultaten in het wetenschappelijk tijdschrift BRAIN. Hij liet motorische zenuwen uitgroeien vanuit stamcellen van CMT type 2 patiënten. In deze zenuwcellen vond hij opvallende gemeenschappelijke kenmerken die te maken hebben met CMT; zoals een verstoord transport in axonen (dit zijn de zenuwuitlopers) en een verstoring van mitochondriën (dit zijn de energiefabriekjes) in deze zenuwcellen. Het aanpakken van deze gemeenschappelijke mechanismen kan een nieuwe start betekenen voor de ontwikkeling en het onderzoek naar therapieën, niet enkel voor één specifiek CMT subtype, maar voor een grotere groep van personen met CMT.

We gebruiken hiervoor stamcellen die werden afgeleid van gezonde vrijwilligers en personen met verschillende subtypes van CMT2 (CMT2A, CMT2E, CMT2F, CMT2L), veroorzaakt door afwijkingen in de meest voorkomende genen die aan de basis liggen van CMT. Deze geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) zijn afgeleid van huidcellen en worden gereprogrammeerd tot hun embryonale staat. Door het toedienen van zenuwgroeifactoren zullen deze iPSC’s zich ontwikkelen tot motorische of sensorische zenuwcellen en deze cellen zijn essentieel in CMT.

BESLUIT: Het onderzoek van verschillende CMT2-iPSC afgeleide zenuwcellijnen heeft geleid tot de identificatie van veel voorkomende stoornissen in axonaal transport en mitochondriale functie. Met deze aanpak, vonden we dat gemeenschappelijke doelwitten kunnen worden geïdentificeerd, zoals de ‘dual leucine zipper kinase’ (DLK). Dit DLK- proteïne kan men therapeutisch onderdrukken met een ‘inhibitor’ en dit geeft een gedeeltelijk herstel van het axonaal transport en het mitochondrium. Dit zou een belangrijke stap voorwaarts kunnen zijn voor de identificatie van nieuwe medicijnen die voor een grotere groep van CMT-patiënten in aanmerking kunnen komen.

Volgend wetenschappelijk artikel verwijst naar 'Induced pluripotent stem cell-derived motor neurons of CMT type 2 patients reveal progressive mitochondrial dysfunction'

September 2021 - Met dank aan Jori voor de vertaling, Spierziekten Vlaanderen

Jonas Van Lent,1,2 Peter Verstraelen,3 Bob Asselbergh,4,5 Elias Adriaenssens,1,2 Ligia Mateiu,4 Christophe Verbist,6 Vicky De Winter,1,2 Kristal Eggermont,7,8 Ludo Van Den Bosch,7,8 Winnok H. De Vos3 en Vincent Timmerman1,2

Axonale Charcot-Marie-Tooth neuropathieën (CMTtype2) worden veroorzaakt door erfelijke mutaties in verschillende genen in verschillende banen. De types van genen en de verscheidenheid van mutaties weerspiegelen de klinische en genetische heterogeniteit in CMT2 aandoening, wat de diagnose compliceert en de ontwikkeling van therapieën heeft geremd. Hier gebruikten we CMT2 patiënt ontbrekende pluropotente stamcellen (ipscs) om gebruikelijke keurmerken van axonale degeneratie gedeeld door verschillende cmt2 subtypes te identificeren. We vergeleken de cellulaire fenotypes van neuronen gedifferentieerd van CMT 2 patiënt iPSCs met die van gezonde controles en een CRISPR/Cas9 gecorrigeerde isogene lijn.

Onze resultaten demonstreerden neuriet netwerk veranderingen samen met extracellulaire elektrofysiologische afwijkingen in de gedifferentieerde motorische neuronen. Progressieve tekorten in mitochondriale en lysosomale trafiek, evenals in mitochondriale morfologie, werden waargenomen in alle CMT2 patiënt lijnen. Differentiatie van dezelfde CMT2 iPSC lijnen in perifere sensorische neuronen gaf alleen aanleiding tot cellulaire fenotypes in subtypes met sensorische betrokkenheid, wat de notie ondersteunt dat sommige genmutaties voornamelijk motorische neuronen beïnvloeden. We onthulden een gemeenschappelijke mitochondriale disfunctie in CMT2-afgeleide motorneuronen, ondersteund door veranderingen in het expressiepatroon en oxidatieve fosforylering, die gerecapituleerd kon worden in de heupzenuw van een symptomatisch muismodel.

Remming van een dubbel leucine rits kinase zou de mitochondriale ziekte fenotypes in CMT2 subtypes gedeeltelijk kunnen verbeteren. Al met al onthullen onze gegevens gedeelde cellulaire fenotypes in verschillende CMT2 subtypes en suggereren dat het aanpakken van dergelijke gemeenschappelijke pathomechanismen de ontwikkeling van een uniforme behandeling voor CMT2 mogelijk zou kunnen maken.

1 Perifere Neuropathie Onderzoeksgroep, Departement Biomedische Wetenschappen, Universiteit Antwerpen, Antwerpen, 2610, België

2 Laboratorium Neurogenetica, Instituut Born Bunge, Antwerpen, 2610, België

3 Laboratorium voor Celbiologie en Histologie, Departement Diergeneeskunde, Universiteit Antwerpen, Antwerpen, 2610, België

4 Neuromics Support Facility, VIB Centrum voor Moleculaire Neurologie, VIB, Antwerpen, 2610, België

5 Neuromics Support Facility, Departement Biomedische Wetenschappen, Universiteit Antwerpen, Antwerpen, 2610, België

6 Laboratorium voor Moleculaire Cellulaire en Netwerk Exciteerbaarheid, Departement Biomedische Wetenschappen, Universiteit Antwerpen, 2610, België Antwerpen, Antwerpen, 2610, België

7 Departement Neurowetenschappen, Experimentele Neurologie, en Leuven Herseninstituut, KU Leuven-Universiteit van Leuven, Leuven, 3000, België

8 VIB-Centrum voor Hersen- en Ziekteonderzoek, Laboratorium voor Neurobiologie, Leuven, 3000, België

 

Correspondentie naar: Vincent Timmerman, PhD

Onderzoeksgroep Perifere Neuropathie, Universiteit Antwerpen

Universiteitsplein 1, BE-2610, Antwerpen, België

E-mail: vincent.timmerman@uantwerpen.be

Trefwoorden: Charcot-Marie-Tooth neuropathie; iPSC-afgeleide motorische en sensorische neuronen; fenotypering; mitochondriale disfunctie; dubbele leucine kinase inhibitor

Afkortingen: CMT=Charcot-Marie-Tooth; DLK=dual leucine kinase; iPSC=geïnduceerde pluripotente stamcel

Introductie

De ziekte van Charcot-Marie-Tooth (CMT) is een erfelijke perifere neuropathie geassocieerd met dominante of recessieve mutaties in een breed spectrum van genen, waarvan vele alomtegenwoordige en onmisbare functies vervullen in bijna elke menselijke cel. Toch lijkt de impact van ziekte-veroorzakende veroorzakende mutaties in deze genen beperkt tot het PNS. Meer dan 1000 mutaties in meer dan 90 verschillende CMT ziekte-geassocieerde genen zijn tot op heden gerapporteerd.1,2 Intrigerend is dat de ziekte niet alleen genetisch maar ook klinisch heterogeen is. CMT wordt in grote lijnen ingedeeld in demyeliniserende (CMT1) en axonale (CMT2) vormen, afhankelijk van het feit of de primaire stoornissen optreden in de myeliniserende Schwann cel of in het neuronale axon, respectievelijk. CMT1A, het meest voorkomende CMT-subtype, vertegenwoordigt 40-50% van alle gevallen van CMT, gevolgd door CMT2, dat 20% uitmaakt.3 Merk ook op dat enkele tussenliggende CMT-subtypen zijn erkend vanwege de overlap in klinische fenotypen tussen CMT1 en CMT2 die binnen dezelfde familie voorkomen. Bovendien vertonen sommige CMT2 klinische entiteiten fenotypische overlap vertonen met distale erfelijke motorische neuropathieën en andere verwante aandoeningen, wat de classificatie van erfelijke perifere neuropathieën nog ingewikkelder maakt.4

In de afgelopen 10 jaar hebben belangrijke vorderingen in het biologisch begrip van de ziekte, verkregen uit celbiologische studies en transgene knaagdiermodellen, geleid tot de identificatie van verscheidene mogelijke aangrijpingspunten voor geneesmiddelen tegen CMT. Ondanks enkele bemoedigende preklinische resultaten is er echter nog geen klinisch succesvolle behandeling gevonden.

Dit suggereert een noodzaak om de belangrijkste bevindingen van bestaande cellulaire en muismodellen te extrapoleren en te valideren naar andere biologisch en klinisch relevante modellen die de ziekte bij de mens kunnen nabootsen. Met name voor neurodegeneratieve ziekten vormen neuronen afkomstig van patiënt specifieke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) een waardevolle bron voor ziektemodellering en preklinische studies, die anders alleen beschikbaar zijn na het nemen van weefselmonsters na overlijden.4-6

De meeste inspanningen voor de ontwikkeling van therapieën zijn geconcentreerd op CMT1 vanwege de grotere ziektelast, waardoor een dringende onbeantwoorde behoefte aan behandeling in de meer diverse groep van CMT2 patiënten bestaat. De fragmentatie van het CMT2 landschap, veroorzaakt door het grote aantal verschillende genen en het lage aantal patiënten per genmutatie, heeft de ontwikkeling van doeltreffende geneesmiddelen verhinderd. Meer dan 50 oorzakelijke genen zijn reeds geïdentificeerd voor CMT2 (de OMIM-genennomenclatuur voor ziekten begint met CMT2A en overschrijdt de alfabetische nummering, https://www.omim.org/), en toch blijven bijna 60% van de CMT2 patiënten zonder een genetische diagnose.4,7 Dit maakt CMT tot een van de meest genetisch diverse erfelijke aandoeningen en brengt unieke uitdagingen met zich mee bij het identificeren van geneesmiddelen, in het bijzonder voor CMT2.

Daarom hebben we in deze studie gebruik gemaakt van iPSC technologie om meerdere CMT2 subtypes te bestuderen, die de meest voorkomende CMT2 causale genen omvatten, en deze te differentiëren in iPSC-afgeleide motorische en sensorische neuronen. Onze gegevens tonen aan dat patiënt specifieke motorische en sensorische neuronen de ziekteverschijnselen van CMT2 weerspiegelen. We stellen een algemene tendens vast naar een afname van de neurietnetwerkdichtheid, samen met veranderingen in exciteerbaarheid. We melden ook progressief aangetaste axonale organel verkeer. evenals afwijkingen in het mitochondriale expressiepatroon, morfologie en oxidatieve fosforylering. Identificatie van deze gemeenschappelijk pathomechanisme(n) kan aantrekkelijke wegen openen voor geneesmiddelenontwikkeling, ondersteund door de bevinding dat remming van een dubbel leucinekinase (DLK) in staat is de mitochondriale disfunctie in twee subtypes van CMT2 gedeeltelijk te herstellen.

Materialen en methoden

Generatie en onderhoud van iPSCs

Primaire menselijke fibroblastculturen werden verkregen uit huidbiopten van vijf niet-verwante CMT2 patiënten en twee gezonde niet-verwante controle proefpersonen (supplementaire tabel 1). Menselijke iPSC lijnen (drie klonen/ genotype) werden gegenereerd en grondig gekarakteriseerd door het Stamcel Instituut, Universiteit van Leuven, België, zoals voorheen beschreven 8 Het belangrijkste is dat zowel de patiënt en controle lijnen samen werden geherprogrammeerd met behulp van Sendai virus. IPSCs werden gehandhaafd op MatrigelVR gecoate platen (734-1440, VWR Biotechnologies) in Essential 8TM Flex medium en supplement (A2858501, Thermo Fisher). RevitaCellTM supplement (A2644501, Thermo Fisher) werd aanvullend gebruikt om iPSC's te doen herleven en de celoverleving te verbeteren. Het medium werd om de dag ververst en bij het bereiken van confluentie werden iPSC's gepasseerd met behulp van een korte incubatie van 2min met Versene (EDTA) (LO BE17-711E, Westburg), gevolgd door het schrapen van de cellen in het Essential 8TM Flex medium. De iPSC-lijnen werden bij 37C in een bevochtigde 5% kooldioxide incubator. Alle iPSC-lijnen werden negatief getest op Mycoplasma. Alle experimenten uitgevoerd met patiëntmateriaal werden goedgekeurd door de Commissie voor Medische Ethiek, Universiteit Antwerpen.

 

Differentiatie van iPSCs in motorische neuronen

De differentiatie van de iPSC's in motorneuronen was gebaseerd op een eerder gepubliceerd protocol.9 In het kort: aan het begin van de differentiatie werd Essential 8TM Flex medium vervangen door neuronaal medium, bestaande uit NeurobasalTM Medium (10888022, Thermo Fisher), DMEM/F12 medium (31330038, Thermo Fisher), N2 supplement (17502048, Thermo Fisher), B-27TM supplement (zonder vitamineA) (12587010, Thermo Fisher), GlutaMAXTM 35050061, Thermo Fisher), b-mercaptoethanol (11528926, Thermo Fisher) en ascorbinezuur (A8960-5G, Sigma-Aldrich). RevitaCellTM werd gebruikt om de overleving van de cellen te verbeteren. Tijdens de eerste 2 dagen, werden dubbele SMAD-remmer SB431542 (1614/10, Bio-Techne), dubbele SMAD-remmer LDN-193189 (QT106329, Selleck Chemicals) en WNT-antagonist CHIR99021 (4423/10, Bio-Techne) toegevoegd aan het neuronale medium. Op de volgende dagen werd de helft van het medium vervangen door media die verbindingen bevatten die nodig zijn voor de differentiatie en maturatie van motorneuronen. De gebruikte verbindingen waren: retinoïnezuur (R2625-50MG, Sigma Aldrich), gladgestreken agonist (SAG, 4366/1, Bio-Techne), van de hersenen afgeleide neurotrofische factor (BDNF, 450-02, Peprotech), van gliale cel afgeleide neurotrofe factor (GDNF, 450-10, Peprotech), c-secretase remmer DAPT (2634/10, Bio-Techne), ciliaire neurotrofe factor (CNTF, 450-13, Peprotech) en laminine (L2020-1MG, Sigma Aldrich). Motorische neuronen werden uitgezet op met laminine gecoate platen bij een dichtheid van 105 cellen/ml. Bovendien, om de zuiverheid van de van de motorische neuronen te verbeteren, werd een enkele behandeling met 1 qM cytosine b-D-arabinofuranoside (Ara-C, C1768, Sigma Aldrich) uitgevoerd op dag 14.

 

Differentiatie van iPSC's in sensorische neuronen

Differentiatie van de iPSC's in sensorische neuronen werd aangepast aan een eerdere studie.10 Kort gezegd, Essential 8TM Flex medium werd vervangen door knock-out serum vervangend medium (KSR) bestaande uit KnockOutTM DMEM (10829018, Thermo Fisher), KnockOutTM Serum Vervanging (10828028, Thermo Fisher), GlutaMAXTM, niet-essentiële aminozuren (11140050, Thermo Fisher) en b-mercaptoethanol. RevitaCellTM werd gebruikt om de overleving van de cellen te verbeteren. SB431542 en LDN- 193189 werden toegevoegd aan de KSR medium om voorste neuro ectoderm specificatie te bevorderen. Op dag 2 werden CHIR99021, DAPT en krachtige en selectieve vasculaire endotheliale groeifactor receptor en fibroblast groeifactor receptor remmer SU5402 (SU, 3300, Tocris) toegevoegd aan het KSRmedium. Het medium werd vervolgens geleidelijk overgebracht in neuronaal medium bestaande uit neurobasaal medium, N2-supplement, B-27TM supplement (zonder vitamine A), GlutaMAXTM en b-mercaptoethanol. Aanvullende verbindingen die werden gebruikt om bij neurale crestcellen en sensorische neuronen differentiatie en rijping te bevorderen waren: ascorbinezuur, b-nerve growth factor (450-34, Peprotech), neurotrophin-3 (450-03, Peprotech), BDNF en GDNF. Sensorische neuronen werden gerepliceerd op met MatrigelVR gecoate platen bij een dichtheid van 2,5 x 105 cellen/ml. Bovendien, zoals in onze motor neuron protocol, werd een eenmalige behandeling met 1 qM Ara-C uitgevoerd op dag 14.

 

Micro-elektrode reeks analyse

Gedissocieerde embryoide lichaampjes werden uitgezet op micro-elektrode reeksen bij een uiteindelijke dichtheid van 50 000 cellen/bron. De micro-elektrode serie platen (24W300/30G-288, Multichannel Systems) waren samengesteld uit 24 bronnen, die elk 12 met PEDOT beklede goudelektroden bevatten ( 300 mm afstand tussen de elektroden en een elektrodiameter van 30 mm). Op dag 16 van het differentiatieprotocol, werd het medium geleidelijk overgeschakeld op BrainPhysTM neuronaal medium (05790, STEMCELL Technologies) om het aandeel van synaptisch actieve neuronen te verhogen. De spontane elektrische activiteit van iPSC-afgeleide motorneuronen werd opgenomen (300 s) met een samplingfrequentie van 25 kHz tijdens verschillende ontwikkelingsstadia. Analyse van alle micro-electrode serie activiteit en gegevensverwerking werd uitgevoerd met op maat geschreven MATLAB scripts (The Mathworks, MA, USA). Actiepotentiaal en netwerk-burst detectie werd uitgevoerd met behulp van de QSpike Tools pakket.11 In het kort, ruwe sporen werden gefilterd door een banddoorlaatfilter gevolgd door piekdetectie waarvan de drempel ten opzichte van de mediaan van de opgenomen spanning ligt. Deze drempeloverschrijdingen werden gebruikt in verdere analyses; elk van deze overschrijdingen vertegenwoordigde een vermoedelijke actiepotentiaal detectie op een elektrode. Als meer dan 0,02 van deze voorvallen werden gedetecteerd per seconde op een bepaalde micro-elektrode, werd de elektrode gelabeld actief. Wanneer >30% van de actieve elektroden piekactiviteit toonden in een venster van 20 ms, werd het geclassificeerd als een netwerk uitbarsting-een netwerk-brede synchronisatie epoch. Het einde van dergelijke uitbarstingen werd bepaald wanneer het netwerk-brede activiteit was <80% van de maximale activiteit in de uitbarsting. Om te bepalen start en einde van de uitbarstingspunten nauwkeurig te bepalen, werd een 1 ms piektijd histogram geconvolueerd met een Gaussiaans venster. De start en het einde werden vervolgens bepaald op de kruising van relatieve drempels. Verschillende andere kwaliteitsvoorwaarden waren van toepassing; een uitbarsting moest minstens 100 ms lang zijn, uitbarstingen met een interval korter dan 100 ms werden samengenomen als één uitbarsting en minstens 30% van de actieve elektroden namen deel aan de uitbarsting.

 

Axonaal transport en mitochondriale morfologie analyse

Motorische en sensorische neuronen werden gekweekt in 8-well Ibidi platen (80826, Proxylab) en geïncubeerd met een eindconcentratie van 250 nM MitoTrackerTM Red CMH2Xros (M7513, Thermo Fisher) of 100 nM van LysoTrackerTM Red DND-99 (L7528, Thermo Fisher) in neuronaal medium gedurende 25 min bij 37C. Daarna werd het medium verwijderd en vers neuronaal medium werd toegevoegd. Live-cel beeldvorming bij 540 nm werd uitgevoerd met behulp van een Carl Zeiss Axiovert 200 M microscoop uitgerust met een incubatiekamer (37C, 5% CO2). Beelden werden genomen om de 2 s gedurende 3 min met een AxioCam MR Rev3 camera en 40 PlanNeofluar (1,3 NA) objectief, wat resulteert in 90 frames. Beelden werden bekeken met behulp van de AxioVision LE software (versie 4.9) en geanalyseerd met de Fiji distributie van ImageJ.12,13 Om organellulair transport te analyseren, werden kymografieën gegenereerd door gesegmenteerde lijnen te tekenen op de neurieten en gebruik te maken van de Fiji 'Multi Kymograph' functie bij lijndikte 3. Uit de kymografieën werden de organelsnelheden geëxtraheerd door rechte lijnen te trekken op structuren die met constante snelheid bewegen (rechte lijnen op de kymograaf). De tangens van de hoek van deze lijn vertegenwoordigt de snelheid (mm/s) na kalibratie (2 s/pixel in de verticale y-richting en 0,16125 mm/pixel in de horizontale x-richting). Het percentage bewegende organellen werd berekend door de bewegende organellen te delen door het totale aantal organellen (inclusief rechte verticale lijnen in de kymograaf). Per opname werden ten minste vijf kymografieën gemaakt. In de motorneuronen werden een mitochondriale snelheid >1,5 mm/s en lysosomale snelheid >2 mm/s als uitschieters beschouwd, terwijl in de sensorische neuronen een mitochondriale snelheid >1 mm/s en lysosomale snelheid >1.5 mm/s als uitschieters werden beschouwd. Het eerste frame van de beeldsequentie werd ook gebruikt om de mitochondriale morfologie te meten door het detecteren van individuele mitochondriën segmenten (zoals eerder afgebeeld 14). Kort gezegd, werd een segmentatie procedure uitgevoerd met behulp van een ImageJ macro script dat globale (Mediaan-methode) en lokale (Phansalkar methode) automatische intensiteit dorsen en Booleaanse operaties op de binaire maskers combineert. De vorm factoren (hoogte-breedteverhouding en circulariteit) van mitochondriale segmenten werden gemeten om de mitochondriale morfologie te beschrijven.

 

Meten van mitochondriaal zuurstofverbruik

De motorische neuronen werden gekweekt op 8-well Seahorse XFp miniplaten (103025-100, Agilent Technologies). Voorafgaand aan de Cell Mito Stress Test (103010-100, Agilent Technologies), werd het neuronale medium veranderd in Seahorse XF DMEM medium pH 7.4, inclusief de Seahorse XF supplementen (glucose, pyruvaat en glutamine) (103680-100, Agilent Technologies). De Seahorse-injectiepoorten op het sensorpatroon werden gevuld met 1 qM oligomycine (poort A), 2 qM carbonilcyanide p-triflouromethoxyphenylhydrazone (FCCP) (poort B) en 0,5 qM Rotenone/Antimycine A (poort C). Alle mitochondriale remmers werden aangekocht bij Agilent Technologies. Tijdens de test werd het zuurstofverbruik gemeten met behulp van de Seahorse XF HS Mini Analyzer (Agilent Technologies) en vervolgens genormaliseerd naar het totale eiwitgehalte en gekwantificeerd volgens de instructies van de fabrikant.

 

Behandeling met medicijnen

Motor neuronen werden behandeld met 1qM van DLK-remmer (GNE-8505, vriendelijk geproduceerd en geleverd door Janssen Pharmaceutica, Beerse, België) vanaf dag 11 en vervolgens ververst bij elke media verandering. Een gelijkwaardige hoeveelheid dimethylsulfoxide (DMSO) werd gebruikt als draagstof.

 

Statistische analyse

Alle experimenten werden ten minste in drievoud uitgevoerd, verzameld van onafhankelijke differentiaties (behalve voor de elektronenmicroscopie studie en mtDNA kopiegetal kwantificering). Statistische analyse werd uitgevoerd met GraphPad Prism (versie 8.3.0). De normale verdeling van de gegevens werd getest met de Shapiro-Wilk test. De vergelijking van twee groepen werd geëvalueerd met de Student's t-test (normale verdeling) of de Mann-Whitney U-test. Gegevens die meer dan twee groepen bevatten, werden geanalyseerd met een eenzijdige ANOVA gevolgd door de meervoudige vergelijkingstest van Dunnett test (normale verdeling) of een niet-parametrische Kruskal-Wallis test met Dunn's correctie voor meervoudige vergelijkingen. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001 werden als significant beschouwd. De gegevenswaarden vertegenwoordigen het gemiddelde 6 standaardfout van het gemiddelde (SEM), behalve waar anders vermeld.

 

Beschikbaarheid van gegevens

De gegenereerde gegevens zijn beschikbaar bij de corresponderende auteur op redelijk verzoek. Het Acapella script, geschreven om de beelden verkregen met de Opera Phenix High Content Imaging systeem te kwantificeren, is beschikbaar op GitHub (https://github.com/VerschuurenM/ NeuronalConnectivity).

Discussie

Erfelijke aandoeningen worden vaak veroorzaakt door een selecte groep genen. Een van de bekendste uitzonderingen is de axonale vorm van CMT neuropathie, veroorzaakt door een groot aantal mutaties in meer dan 50 ziekte-geassocieerde genen. Deze genetische diversiteit, nog gecompliceerd door klinische heterogeniteit, heeft geleid tot de associatie tussen axonale CMT en een groot aantal ziekteverlopen. Een van de belangrijkste redenen voor de achterstand in de ontwikkeling van therapieën voor CMT2 is dat de gedeelde en gen-specifieke routes grotendeels onopgelost blijven. Onze studie heeft deze vraag beantwoord en bepaalde gedeelde routes geïdentificeerd.

Onze gegevens tonen aan dat er gemeenschappelijke veranderingen in de mitochondriale morfologie, mitochondriale genexpressie patronen, extracellulaire elektrofysiologie, oxidatieve fosforylering en mtDNA kopiegetal in vijf verschillende axonale CMT iPSC lijnen die een diverse set van autosomaal dominante CMT2 genen vertegenwoordigen. Opmerkelijk is dat een veranderd mitochondriaal metabolisch defect recent werd gerapporteerd in iPSC-afgeleide motorneuronen van CMTX6 patiënten.26 Deze resultaten geven aan dat mitochondriale energietekorten een gemeenschappelijk kenmerk zouden kunnen vormen van axonale CMT neuropathieën. Gezien de lengte van deze neuronen, die kan oplopen tot 1 m bij volwassenen, kan dit nog verergerd worden door axonale transport defecten. Terwijl hoge ATP niveaus nodig zijn om axonale overleving en zenuwgeleiding te ondersteunen bij bijvoorbeeld de knopen van Ranvier, zouden tekorten in zowel transport als energieproductie een dubbele klap kunnen vormen waardoor het axon deze hoge energievraag niet kan volhouden en uiteindelijk leidt tot axonale disfunctie. Het is daarom niet verwonderlijk dat er axonale transportdefecten of mitochondriale disfunctie zijn waargenomen in vele modellen van CMT ziekte (zoals eerder besproken door Beijer et al.39). Echter, of deze factoren werkelijk bijdragen aan de pathogenese van de ziekte of dat de aantasting van deze functies eenvoudigweg een eindpunt is van een degenererend axon is onduidelijk gebleven.

Onze resultaten tonen aan dat, naast gen-specifieke fenotypes, defecten in mitochondria en axonaal transport gemeenschappelijk zijn in verschillende CMT2 subtypes en dat dit niet eenvoudigweg stroomafwaartse eindpunten zijn van axonale degeneratie. Dit wordt ondersteund door het feit dat deze defecten progressief zijn en samenvallen met algemene elektrofysiologische en neuriet netwerk tekortkomingen. Deze resultaten impliceren daarom ook dat therapieën gericht op het herstellen van axonaal transport of mitochondriale activiteit het potentieel hebben om axonale degeneratie te redden in meerdere CMT2 subtypes. Het blijft echter onduidelijk welke van deze parameters essentieel is voor het herstel van axonale degeneratie of dat zowel transport als mitochondriale activiteit hersteld moeten worden om axonale degeneratie te voorkomen.

Het complexe samenspel tussen axonaal transport en mitochondriale activiteit is momenteel onvolledig begrepen. Studies met de mito-KillerRed molecule, die leidt tot het vrijkomen van reactieve zuurstofspecies bij fotoactivatie, hebben aangetoond dat lokale activatie in een subdomein van de neuriet leidt tot mitochondriale blokkering.40 Vermoedelijk probeert de zenuw de verspreiding van oxidatieve schade te voorkomen door de mitochondriën op de plaats van het letsel in quarantaine te plaatsen. Op dezelfde manier treedt mitofagie van disfunctionele mitochondriën langs de neuriet ook op in het axon zelf.41 Het lijkt er dus op dat lokale mitochondriale tekorten direct kunnen leiden tot mitochondriale blokkering. Hoe dit op moleculair niveau gecontroleerd wordt is minder duidelijk, maar het zou een omschakeling kunnen inhouden van dynamische kinesine en dyneïne transporters naar statische syntaphiline verankeringseiwitten.42 Bovendien kunnen inter-organel contacten het lot van disfunctionele mitochondriën verder bepalen. Specifiek, mitochondria-geassocieerde membranen zijn contactplaatsen tussen mitochondria en het endoplasmatisch reticulum en worden op grote schaal betrokken bij neurodegeneratie.43 Bovendien is voor CMT2 aangetoond dat defecten in mitochondria-geassocieerde membranen bijdragen aan mutant MFN2 pathologie.44

Een belangrijke sensor van zulke lokale oxidatieve schade is AMPK.45 Onze gegevens tonen een verhoogde activering van AMPK in de gemuteerde CMT lijnen wat wijst op een primair mitochondriaal tekort. Bovendien hebben we waargenomen dat zowel axonaal transport en mitochondriale activiteit tekorten optreden op hetzelfde moment, wat verder suggereert dat ze met elkaar verbonden zijn, en het herstel van een zou kunnen leiden tot verbetering van de andere. Dit idee wordt ondersteund door het feit dat DLK remming zowel het mitochondriaal transport, de morfologie en de functionaliteit in MFN2R94Q en NEFLP8R patiënt motor neuron lijnen verbeterde. Bovendien werd in drie CMT2 muismodellen aangetoond dat HDAC6 remmers de tubuline acetylering kunnen herstellen en bijgevolg het axonaal transport en het totaal aantal mitochondriën kunnen verbeteren.22,46 Voor HDAC6 remmers is hun primaire werkingsmechanisme echter minder duidelijk. Ze vergemakkelijken axonaal transport door de controle van tubuline acetylatie niveaus, maar HDAC6 controleert ook sterk de acetylatie van Miro1 en dus mitochondriaal transport.47 Bovendien is het verlies van Miro1 voldoende om axonale degeneratie in hippocampale neuronen te induceren.48 Dus niet alleen mitochondriale disfunctie kan axonale degeneratie veroorzaken, mitochondriaal transport is even belangrijk voor het behoud van axonale integriteit door het verwijderen van beschadigde organellen en het aanvullen van het axon met gezonde mitochondriën. In de toekomst zal het dus belangrijk zijn om de moleculaire details te ontrafelen van het mogelijke onderlinge verband tussen axonaal transport en mitochondriale disfunctie in CMT2. Bovendien kunnen er andere gemeenschappelijke routes bestaan, zoals endoplasmatisch reticulum-fagie, dat een gemeenschappelijke route lijkt te zijn voor een groep genen die gelinkt zijn aan sensorische neuropathieën.49,50

 Samenvattend hebben we gemeenschappelijke ziektemechanismen geïdentificeerd in neuronen gedifferentieerd uit CMT2 patiënt-afgeleide iPSC lijnen en dit opent nieuwe, aanvullende mogelijkheden voor de ontwikkeling van geneesmiddelen voor erfelijke neuropathieën, die mogelijk gunstig zullen zijn voor een grotere groep CMT patiënten.

Resultaten

Generatie en karakterisering van CMT2 iPSC's

Een bijzondere uitdaging bij het gebruik van iPSC's voor het bestuderen van een genetisch diverse ziekte zoals CMT komt niet alleen voort uit verschillen tussen genetische varianten, maar ook uit verschillen die ontstaan door de ontwikkeling van iPSC's in verschillende laboratoria. In dit opzicht, en met de huidige technologie kan eenzelfde mutatie die in twee verschillende laboratoria is gegenereerd, zeer verschillende experimentele resultaten opleveren. Dit is een belemmering geweest voor de identificatie van gedeelde moleculaire tekorten tussen verschillende CMT2 subtypes. Om deze grote uitdaging te overwinnen, genereerden wij iPSC lijnen van vijf verschillende CMT2 mutaties samen met twee gezonde controles (Fig. 1A, B en Supplementaire Tabel 1) tegelijkertijd en binnen dezelfde onderzoeksomgeving. In deze studie hebben we ons gericht op de volgende genmutaties die de respectievelijke gemeenschappelijke CMT2 subtypes vertegenwoordigen: MFN2R94Q (CMT2A), NEFLP8R (CMT2E), HSPB8K141N (CMT2L), HSPB1G84R (CMT2F) en HSPB1P182L (CMT2F). Deze geselecteerde genen en hun respectievelijke mutaties omvatten de meest voorkomende vormen van axonale CMT die tot op heden geïdentificeerd zijn.15-18

Om rekening te houden met mogelijke variabiliteit, bevat deze lijst ook twee verschillende mutaties in hetzelfde gen (HSPB1G84R en HSPB1P182L) met verschillende ernst van de ziekte en die invloed hebben op verschillende eiwitdomeinen van HSPB1.19 De herprogrammering van fibroblasten werd uitgevoerd met behulp van een Sendai-virus, bestaande uit vier herprogrammering factoren (Oct4, Sox2, Klf4 en cMyc). Pluripotentie werd bevestigd door immunokleuring voor Nanog, Oct4, SSEA4, Sox2, Tra 1-60 en Tra 1-81 (Supplementary Fig. 1A). Een kwantitatieve analyse van zelfvernieuwing en drie-fase differentiatie potentieel (TaqManVR hPSC ScorecardTM assay) werd uitgevoerd (Aanvullende Fig. 1B). Bovendien, alle iPSC lijnen toonden pluripotente stamcel markers weergegeven door RT-qPCR voor Oct4, Sox2 en Nanog (Supplementary Fig. 1C). De afwezigheid van de relatieve virale expressie van Sendai en c-Myc werd bevestigd door RTqPCR (Supplementary Fig. 1D). Verdere karakterisering werd uitgevoerd door DNA vingerafdrukken, die identieke single nucleotide polymorfisme profielen lieten zien met het corresponderende fibroblast monster (Supplementaire tabel 2). Ten slotte, om rekening te houden voor potentiële variabiliteit, genereerden we een isogene controlelijn waarin de MFN2R94Q mutatie (MFN2ISO) werd gered met behulp van de CRISPR / Cas9 Gen editing-technologie (Fig. 1B en Supplementary Fig. 8A). Samen moet deze reeks iPSC-lijnen de nodige instrumenten verschaffen om natuurlijke variabiliteit te filteren en moleculaire veranderingen te identificeren die werkelijk van de ziekte afstammen.

 

Differentiatie van iPSC's naar motorneuronen

Differentiatie van iPSCs tot motorneuronen was gebaseerd op een eerder gepubliceerd protocol.9 De verschillende in vivo neuronale ontwikkelingsstadia werden gesimuleerd door toevoeging van kleine moleculen in vitro (Fig. 1C). Dit protocol, in combinatie met een enkele behandeling met AraC op dag 14, zorgde voor een hoge zuiverheid motor neuron culturen. Immunokleuring onthulde dat alle iPSC-afgeleide motor neuronen positief waren voor MAP2, Islt1 en ChAT (Fig. 1D). Bovendien toonde RT-qPCR een toename aangetoond in de relatieve expressie van ChAT en HB9 in de tijd van iPSC kolonies (Dag 0) tot volwassen motorneuronen (Supplementaire Fig. 1E). Geen significante verschillen tussen volwassen patiënt lijnen en controles werden waargenomen. Bovendien, de isogene MFN2ISO lijn was ook in staat om succesvol te differentiëren in motorische neuronen. Deze patiënt en controle iPSC-afgeleide motor neuron lijnen werden gebruikt in deze studie om gemeenschappelijke kenmerken te zoeken die gezonde van axonale CMT ziekte fenotypes onderscheidden.

Om onze lijnen te kenmerken, onderzochten we eerst of we eerder gerapporteerde gen-specifieke fenotypes zouden waarnemen voor bepaalde CMT2 subtypes. Bijvoorbeeld, mutaties in het neurofilament lichte keten gen (NEFL), dat CMT2E veroorzaakt, verstoren de samenstelling van het intermediaire filament netwerk, door ophoping in de perikarya en neurieten in het bijzonder.20 Wij waren in staat om de lichte neurofilament  (NF-L) inclusies te valideren in zowel het cellichaam als in de neurieten van CMT2E-afgeleide motorneuronen door het uitvoeren van immunokleuring voor NF-L op dag 37 (Supplementaire Fig. 2A). Geblindeerde kwantificering onthulde een significante toename van NF-L vergeleken met gezonde controles, gebruik makend van NF-L signaal drempels (het totale gebied van NF-L insluitsels gedeeld door een achtergrond van NF-L kleuring) (Supplementaire Fig. 2B). Bovendien werden filamenteuze ophopingen bevestigd door ultrastructurele analyse van de NEFLP8R motorneuronlijn (Aanvullende Fig. 2C). Een tweede voorbeeld van een gen-specifiek fenotype is de vorming van HSPB1-positieve aggregaten als gevolg van Cterminale HSPB1 mutaties.21 We valideerden de aanwezigheid van HSPB1 aggregaten in onze iPSC-afgeleide motorneuronen van de HSPB1P182L lijn, met behulp van immunokleuring op dag 37 voor HSPB1 (Supplementary Fig. 3A). Terwijl er geen aggregaten werden gezien voor de N-terminale HSPB1G84R mutatie, bevatte een deel van de HSPB1P182L cellen grote cytoplasmatische aggregaten (Supplementary Fig. 3A). Bovendien bevestigden we een bekende vermindering in a-tubuline acetylatie niveaus voor de HSPB1P182L patiëntenlijn, voor het eerst gerapporteerd in een CMT2F muismodel (Supplementaire Fig. 3B).22 Ten slotte hebben we een afname gerecapituleerd in BAG3 niveaus in iPSC-afgeleide motorneuronen voor de HSPB8K141N mutatie (Supplementaire Fig. 4), een bevinding die is waargenomen en door ons is waargenomen en gerapporteerd in de heupzenuw van 12 maanden oude symptomatische Hspb8K141N/K141N knock-in muizen en weerspiegelt veranderingen in autofagie.23 Concluderend, deze CMT2-afgeleide motorneuronen recapituleren eerder beschreven gen-specifieke veranderingen. Het blijft echter onduidelijk wat deze verschillende CMT2 subtypes verbind.

 

CMT2 motor neuronen vertonen neuriet netwerk tekorten met veranderde extracellulaire elektrofysiologische eigenschappen 

Aangezien veranderingen in het neurietnetwerk werden gerapporteerd in iPSC afgeleide neuronale modellen en in diermodellen van perifere neuropathieën,24,25 trachtten wij na te gaan of een afname in het neurietnetwerk een gemeenschappelijk fenotype zou zijn in onze CMT2 iPSC afgeleide motorneuronen. We pasten twee methoden toe om dit te onderzoeken. Ten eerste analyseerden we fase-contrast beelden van neuronale culturen op dagen 38-50 met behulp van pixel classificatie om het aantal neurieten en cellichamen te segmenteren en te meten (Fig. 2A en B). Aanvullend hierop bestudeerden we het neuronale netwerk op Dagen 25-30 door middel van geautomatiseerde fluorescentie confocale microscopie met hoge doorvoer (Fig. 2C). Van alle iPSC-afgeleide motor neuron lijnen, hadden de twee controlelijnen gemiddeld het dichtste neurietnetwerk in beide soorten analyses. Met een gelijk aantal cellen na 25- 30 dagen (Fig. 2D), werd een statistisch significante afname in neuriet lengte gevonden voor de MFN2R94Q en NEFLP8R lijnen (Fig. 2E). Deze suggereerde dat CMT2 mutaties een negatieve invloed hebben op het neurietnetwerk van iPSC-afgeleide motorneuronen.

 

Om te onderzoeken of deze kleine veranderingen in het neuriet netwerk gekoppeld waren aan veranderingen in neuronale activiteit, voerden we microelectrode serie experimenten uit. De spontane elektrische activiteit van iPSC-afgeleide motorneuronen werd opgenomen met een bemonsteringsfrequentie  van 25 kHz tijdens verschillende ontwikkelingsstadia. Representatieve sporen die werden verzameld over een 300 s opname periode worden getoond en werden gekenmerkt door geïsoleerde en periodieke collectieve gepiekte gebeurtenissen (Fig. 2F). Analyse van de sporen gaven veranderingen aan in de uitbarstingssnelheid voor alle CMT2-afgeleide motorneuronen in vergelijking met de controles (Fig. 2G). De MFN2R94Q en NEFLP8R lijnen toonden een toename van de uitbarstingssnelheid, wat hyper-connectiviteit suggereert. In tegenstelling, de Hitteschok proteïne mutanten (HSPB8K141N, HSPB1G84R en HSPB1P182L) vertoonden een tendens naar een afname van uitbarstingssnelheid, wat wijst op een hypo-connectiviteitstoestand. Hoewel genspecifieke verschillen de tegengestelde trends tussen de verschillende CMT2 subtypes kunnen verklaren, kunnen veranderingen in beide richtingen bijdragen tot neuronale en axonale degeneratie.9,20

 

Progressief axonaal transport en morfologische tekorten in CMT2-afgeleide motor neuronen

Eerdere studies hebben axonale transportdefecten gerapporteerd, zoals verminderde mitochondriale snelheid in iPSC-afgeleide neuronen van CMT2A, CMT2E of CMTX6.20,26 Het blijft echter onbekend of deze kenmerken van axonale degeneratie gemeenschappelijk zijn voor alle CMT2 subtypes. Om na te gaan of dit op zijn minst een gemeenschappelijk kenmerk was in onze vijf CMT2 lijnen, voerden we live-cel beeldvormingsexperimenten uit om mitochondriale en lysosomale verkeer in zowel controle en patiënt iPSC-afgeleide motorneuronen in de tijd met behulp van MitoTrackerTM en LysoTrackerTM kleurstoffen, respectievelijk. We zagen een significante afname van de mitochondriale snelheid in alle van patiënten afgeleide motorneuronen op dagen 38-50 (Fig. 3A), terwijl op dagen 22-28, alleen de MFN2R94Q motor neuronen een afname in mitochondriale snelheid toonden (Aanvullende Fig. 5A). Het percentage van de bewegende mitochondriën was niet significant verschillend; echter, op Dagen 22-28 zagen we een significante afname in de MFN2R94Q patiënt lijn (Supplementary Fig. 5A). Vergelijkbaar met de mitochondriale snelheid, was de lysosomale snelheid significant afgenomen in alle patiënten motorneuronen op Dagen 38- 50 (Fig. 3B), terwijl op Dagen 22-28, de MFN2R94Q, NEFLP8R en HSPB8K141N motorneuronen een trend vertoonden in de richting van een afname van lysosomale snelheid (Supplementaire Fig. 5B). Bovendien werd het percentage van de bewegende lysosomen aanzienlijk verminderd op dagen 38-50 (Supplementaire Fig. 5B). Deze live-cel beeldvorming experimenten toonden aan dat axonale transport in het algemeen werd belemmerd en mitochondriale en lysosomale verkeer verslechterde in de tijd.

Gezien de nauwe band tussen mitochondriale functionaliteit en vorm, bestudeerden we het effect van CMT2 mutaties op de mitochondriale vorm (Fig. 3C). Voor MFN2 mutaties, is het al bekend dat fusie is verstoord, waardoor mitochondriale fragmentatie optreedt.27,28 Echter, voor de andere CMT2 mutanten, is dit nog niet systematisch onderzocht. Om na te gaan of veranderingen in de mitochondriale morfologie een ander gemeenschappelijk kenmerk zouden kunnen vormen, analyseerden wij de mitochondriale vormparameters in motor neuron culturen gelabeld met MitoTrackerTM kleurstof. Onze gegevens onthulden verminderde mitochondriale rek, met een toename in circulariteit (Fig. 3D) en een afname in aspect ratio (Fig. 3E) in alle van de patiënt afgeleide motor neuronen tussen 38 en 50 dagen. Interessant is dat voor de MFN2R94Q en NEFLP8R gemuteerde motorneuronen, dit reeds waarneembaar was op Dagen 22-28 (Aanvullende Fig. 6A en B). Veranderingen in de mitochondriale morfologie voor de MFN2R94Q en NEFLP8R mutant motor neuronen werden verder bevestigd door transmissie elektronen microscopie op Dag 25 Supplementary Fig. 6C en D). Al met al, toonden onze resultaten een progressief aangetast axonaal transport en gefragmenteerde mitochondriale morfologie in alle patiënten lijnen.

 

Motor neuron-specifieke subtypes van CMT2 hebben geen beïnvloeden iPSC-afgeleide sensorische neuronen

Aangezien de MFN2R94Q en NEFLP8R CMT2 patiënten zowel motorische en sensorische symptomen vertoonden (Supplementaire Tabel 1), onderzochten we of deze mutaties ook de sensorische neuronen beïnvloedden. Daarom hebben we iPSCs gedifferentieerd in perifere sensorische neuronen met behulp van een eerder gepubliceerd protocol 10 (Fig. 4A), die een heterogene sensorische neuronale cultuur produceerde.29 Immunokleuring op dag 37 bleek dat alle iPSC-afgeleide sensorische neuronen positief waren voor Beta-III-Tub, BRN3A en TRPV1 (Fig. 4B). Eerst gingen we na of gen-specifieke fenotypes gereproduceerd werden in iPSC-afgeleide sensorische neuronen. We zagen dat NF-L ophopingen ook aanwezig waren in patiënten iPSC-afgeleide sensorische neuronen, zoals blijkt uit een significante toename van NF-L inclusies in de perikarya en neurieten van de NEFLP8R patiënt lijn op Dag 37 (Supplementaire Fig. 2D-E). Voor HSPB1P182L, zagen we alleen een daling van a-tubuline acetylering in iPSC-motor neuronen, maar niet iPSC sensorische neuronen op Dag 37 (Supplementaire Fig. 3C), die in overeenstemming was in lijn met de overheersende motor neuron fenotype in dit type van CMT2 genmutatie. We hebben ook de neuriet lengte gemeten in deze iPSC-afgeleide sensorische neuronen op fase contrast beelden van levende niet-gekleurde neuronen, op dezelfde manier als voor de motor neuronen. Een significante afname in neuriet lengte trad op dagen 38-50 in de MFN2R94Q en NEFLP8R sensorische neuron lijnen (Fig. 4C).

Vervolgens hebben we axonaal transport gemeten met MitoTrackerTM en LysoTrackerTM voor het labelen van respectievelijk deitochondria en de lysosomen. Kymograph analyse toonde een significante vermindering op dagen 38-50 in de mitochondriale en lysosomale snelheden voor de MFN2R94Q en NEFLP8R sensorische neuron lijnen (Fig. 4D). Bovendien werd een verminderd aantal bewegende mitochondriën en lysosomen waargenomen in deze twee patiënten lijnen in vergelijking met zowel de controles (Fig. 4D). We vonden ook dat de mitochondriale vorm in de MFN2R94Q en NEFLP8R sensorische neuronen, vergelijkbaar met motor neuronen, een afname van de aspect ratio (Fig. 4E) onthuld. Merk op dat de snelheid distributie van mitochondriale en lysosomale verkeer duidelijk verschilde tussen de motor en sensorische neuronen: axonale transport snelheden waren significant hoger in de motor neuronen in vergelijking met de sensorische neuronen van gezonde controles (Supplementary Fig. 7A-D). Dit was in lijn met in vivo gegevens waarin axonale verkeer van signalering endosomen aanzienlijk sneller was in motor versus sensorische neuronen van ChAT-eGFP muizen.30 Deze verschillen in snelheid zouden kunnen voortvloeien uit verschillen in de axon dikte tussen motorische en sensorische neuronen. Gecombineerd suggereerden onze resultaten dat neurietlengte, axonaal transport en mitochondriale vorm met name verstoord waren in iPSC afgeleide sensorische neuronen van CMT2 patiënten met sensorische symptomen, terwijl de sensorische neuronen van CMT2 subtypes met een overwegend motorisch-fenotype (HSPB1G84R, HSPB1P182L en HSPB8K141N) onverschillig waren van controle iPSC-afgeleide sensorische neuronen.

 

Het corrigeren van de MFN2R94Q mutatie met behulp van gen-editing herstelt ziekte fenotypes

In deze studie hebben we axonale degeneratie kenmerken waargenomen in gedifferentieerde motorische en sensorische neuronen van de MFN2R94Q patiënt iPSC lijn. We pasten CRISPR / Cas9 toe om de pathogene MFN2R94Q patiënt iPSC lijn naar een gecorrigeerde MFN2ISO lijn te genereren (Fig. 1B en Aanvullende Fig. 8A) en te beoordelen of de correctie de karakteristieke ziektefenotypen herstelt in motorische en sensorische neuronen. Hieruit bleek dat correctie van de MFN2R94Q mutatie neuriet lengte herstelde in iPSC-afgeleide motorische en sensorische neuronen (Supplementaire Fig. 8B, C en G). Ook de verstoringen in de extracellulaire elektrofysiologische eigenschappen werden gecorrigeerd, zoals aangetoond door een herstel van de uitbarstingssnelheid (Supplementary Fig. 8D). De gefragmenteerde mitochondriale morfologie en de veranderde mitochondriale en lysosomale verkeer op dagen 38-50 werden eveneens gecorrigeerd in zowel iPSC-afgeleide motorische en sensorische neuronen afgeleid van de MFN2ISO lijn (Supplementary Fig. 8E, F, H en I). Samengevat, de isogene MFN2ISO lijn herstelde de ziekte fenotype van de MFN2R94Q patiënt lijn, waaruit blijkt dat onze resultaten in iPSC afgeleide motorische en sensorische neuronen echte kenmerken van CMT2A zijn.

 

Veranderd mitochondriaal expressieprofiel in iPSC-afgeleide motorneuronen van CMT2

Om globaal het transcriptomische profiel af te bakenen tussen de twee gezonde controle en vijf CMT2 patiënt iPSC-afgeleide motorneuronen, voerden we bulk RNA-sequencing uit op dag 50 afgeleide motorneuronen. Principale componenten analyse (PCA) toonde aan dat de axonale CMT monsters afzonderlijk van de controles geclusterd waren (Supplementary Fig. 9A). In het transcriptoom van de vijf verschillende CMT2 patiënt-afgeleide motorneuronen, kwamen 2846 genen differentieel tot expressie in vergelijking met beide controles (Fig. 5A). We gebruikten RT-qPCR om enkele van de meest voorkomende differentieel tot expressie komende genen (NKX6-1, CNTN4 en KHDRBS2) te valideren, hetgeen de differentiële expressie van deze transcripten tussen de CMT2 lijnen en de controles bevestigde (Fig. 5B). Om gen-specifieke versus gedeelde differentieel tot expressie komende transcripten te onderscheiden, voerden wij een Venn diagram analyse uit (Fig. 5C). Dit stelde ons in staat om de overlap tussen elk van de CMT2 patiënt motor neuron lijnen te analyseren en een kernprofiel van 740 transcripten te identificeren die werden gedeeld door alle CMT2 genmutaties. Ontologie van genen (GO) analyse van deze gemeenschappelijke differentieel tot expressie komende genen identificeerde verrijkte cellulaire component GO termen zoals 'ademhalingsketen' en 'axon' (Supplementary Fig. 9BandC). Bovendien vonden we in de top geassocieerde verrijkte routes 'axon geleiding route' en de 'PI3K-Akt signalering route' (Supplementary Fig. 9C). Van deze laatste route werd ook aangetoond dat ze onevenwichtig is in CMT knaagdiermodellen.31 

Eén van de top treffers was de 'ademhalingsketen', die dit kernprofiel van verschillend geëxpresseerde genen linkt aan de mitochondriën. We bevestigden dit met een bijkomende PCA, waaruit bleek dat gezonde controles en CMT2 stalen afzonderlijk geclusterd waren wanneer enkel de mitochondriaal gecodeerde genen geanalyseerd werden (Fig. 5E). Dit was in overeenstemming met onze eerdere resultaten die aantoonden dat mitochondriaal transport en morfologie zijn aangetast in alle CMT2 patiënt iPSC lijnen. Om een connectiviteitsnetwerk te construeren van de verschillend tot expressie komende genen die ten grondslag liggen aan de top treffers in de 'ademhalingsketen' term, voerden we GeneMANIA gen netwerk clustering uit (Fig. 5D) en dit toonde aan dat veel van de treffers onderling verbonden waren op meerdere niveaus, variërend van directe proteïne-eiwit interacties tot eiwitten van dezelfde route, verder onderstrepend hoe verschillende CMT2 genen dezelfde mitochondriale processen kunnen ontregelen.

 

Motorneuronen gegenereerd uit CMT2 patiënten hebben een veranderd bio-energetisch profiel

Onze resultaten tot hiertoe toonden aan dat mitochondriaal transport en morfologie ontregeld waren en dat dit kenmerk gemeenschappelijk was voor alle CMT2 motor neuron lijnen gebruikt in deze studie. Het is dan ook niet verwonderlijk dat 'PI3K-Akt signalering' en 'ademhalingsketen' werden geïdentificeerd als geassocieerde GO termen in onze transcriptomische analyse, wat aangeeft dat mitochondriale disfunctie zou kunnen worden waargenomen door cytosolische stress integratoren zoals Akt en AMPK. Daarom gingen we na of de Akt en AMPK fosforylering niveaus verschillend waren in de CMT2 lijnen versus de controles. Dit bevestigde een duidelijke toename van gefosforyleerde Akt en AMPK in alle CMT2 patiënten lijnen (Fig. 6A). Om na te gaan of deze in vitro bevindingen zich ook zouden uitstrekken tot in vivo modellen, isoleerden we de heupzenuw van 1-jarige symptomatische Hspb8K141N/K141N muizen die CMT2L modelleren. Vergelijkbaar met onze waarnemingen in de iPSC-motorneuronen, vonden we een toename van gefosforyleerde Akt en AMPK in de nervus ischiadicus (Fig. 6B). Aangezien de heupzenuw niet uitsluitend bestaat uit motorneuronen, maar ook andere celtypes bevat zoals Schwann cellen, fibroblasten en endotheelcellen, blijft het werkelijke effect op de motorneuronen mogelijk onderschat.

Aangezien AMPK een bekende sensor is voor het cellulaire energiemetabolisme,32 onderzochten we of deze CMT2 mutaties tekortkomingen zouden vertonen in de oxidatieve fosforylering. We onderzochten de mitochondriale ademhaling met behulp van een Seahorse analyser en beoordeelden de mitochondriale functie met de Cell Mito Stress Test assay (Fig. 6C). Metingen van de mitochondriale basale ademhaling op Dagen 38-39 toonden een afname in de MFN2R94Q, NEFLP8R, HSPB8K141N en HSPB1P182L patiënt lijnen (Fig. 6D), die samenviel met de veranderde mitochondriale vorm (Supplementary Fig. 6A en B) en verminderd mtDNA kopie aantal (Supplementary Fig. 11) waargenomen op dit tijdstip. Op 24-25 dagen, een daling van de basale ademhaling en aangetaste mitochondriale morfologie kon al worden waargenomen in de MFN2R94Q en NEFLP8R patiënt motor neuron lijnen (Supplementary Fig. 6A, B, D en Supplementary Fig. 10A). Ten slotte hebben we ook aangetoond dat de isogene MFN2ISO lijn in staat was om defecte oxidatieve fosforylering in de MFN2R94Q patiënt lijn te herstellen, zowel in vroege en late tijdstip experimenten (Supplementary Fig. 10 B en C).

 

DLK inhibitie verbetert mitochondriale dysfunctie in motor neuronen gegenereerd uit CMT2A en CMT2E patiënten

Aangezien onze gegevens aantoonden dat mitochondriale disfunctie een gemeenschappelijk kenmerk was in onze CMT2 lijnen en dat stress routes die hierop een invloed hebben overgeactiveerd zijn, wilden we onderzoeken of het moduleren van deze stress routes een aantal van de ziekte-geassocieerde fenotypes zou kunnen verbeteren. Aangezien MAPK's zich direct en indirect kunnen richten op mitochondria,33,34 onderzochten we of we deze stress-geïnduceerde transcriptionele veranderingen konden aanpakken (Fig. 7A) met behulp van een DLK (ook bekend als MAP3K12) remmer. DLK werkt stroomopwaarts van de stress-responsieve c-Jun N-terminal kinase (JNK) route (een lid van de MAPK eiwit familie) en wordt sterk uitgedrukt in neuronale cellen. Bovendien versterken mitochondriale disfunctie en DLK activatie elkaar in het induceren van axonale schade.35 Bovendien zijn DLK en, in zekere mate, de JNK route ook nauw betrokken bij axonaal organel transport.36 Deze DLK remmer bevindt zich momenteel in een fase I klinische studie voor amyotrofe laterale sclerose (NCT02655614), omdat is aangetoond dat het niet alleen de activatie van JNK vermindert, maar ook de denervatie vertraagt bij de neuromusculaire juncties van SOD1G93A muizen.37 Bovendien wordt het verlies van DLK goed verdragen.38 We richtten ons op de MFN2R94Q en NEFLP8R patiënt motorneuron lijnen, omdat beide de meest ernstig gewijzigde mitochondriale fenotype vertonen, en behandelden de motorneuronen met 1 µM van DLK remmer vanaf dag 11. Om het effect van de behandeling te valideren, werden de totale c-Jun niveaus gemeten en de toename van deze niveaus in de MFN2R94Q en NEFLP8R patiënt motorneuronen lijnen daalde bij remming door DLK (Fig. 7B). Om te bepalen of een dergelijke vermindering van stress signalering zou een positieve invloed op de mitochondriale functionaliteit hebben, behandelden we de motor neuronen met de DLK-remmer en beoordeelde de mitochondriale morfologie, mitochondriale ademhaling en mitochondriaal transport op dagen 38-50 (Fig. 7C-E). Deze experimenten toonden aan dat DLK remming leidde tot een toename van de mitochondriale aspect ratio en basale respiratie in zowel de MFN2R94Q en NEFLP8R lijnen. Bovendien, hoewel niet significant, leidde het tot een lichte toename van de mitochondriale transportsnelheid en het percentage bewegende mitochondriën. Deze resultaten toonden aan dat DLK remming in staat was om mitochondriale disfunctie gedeeltelijk te redden, wat zijn brede therapeutische potentieel aantoont, en dat het richten van dergelijke gedeelde routes de weg zou kunnen effenen voor een universele CMT2 behandeling.

Erkenningen

De auteurs danken de patiënten en controlepersonen die vrijwillig huidbiopten hebben afgestaan om iPSC lijnen te genereren voor onderzoeksdoeleinden met geïnformeerde toestemming. Wij waarderen ook de langdurige samenwerking met de clinici die deze patiënten in eerdere fenotype-genotype correlatie studies hebben gedocumenteerd, dit zijn de professoren Angelika Hahn, Michaela Auer-Grumbach, Pavel Seeman, Peter De Jonghe en Jonathan Baets. Wij hebben de hulp van Dr. Manisha Juneja bij de initiële opleiding van de eerste auteur en het initiëren van enkele motor neuron differentiatie experimenten op prijs gesteld. Wij danken Marlies Verschuuren voor haar hulp bij de analyse van de beeldgegevens. Wij danken ook professor Jean-Pierre Timmermans, dr Isabel Pintelon en mevrouw Karen Sterck van het Antwerps Centrum voor Geavanceerde Microscopie (ACAM) voor hun hulp bij de draaischijf- en elektronenmicroscopie. Verder willen we ook Mike Wijnants bedanken voor kritische discussies tijdens de analyse van de MEA-gegevens.

Financiering

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Universiteit Antwerpen (DOC-PRO4 PhD beurs aan J.V.L., TOP-BOF onderzoeksbeurs N° 38694 aan V.T., BOF onderzoeksbeurs N° 41739 en VLAIO beurs HBC.2016.0534 aan W.D.V.), het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO-Vlaanderen onderzoeksbeurs N° G041416N aan V.T., G017618N aan W.D.V., en FWO postdoc beurs aan EA), de "Association Belge contre les Maladies Neuromusculaires" (ABMM beurzen aan E.A. en V.T.), de Medische Stichting Koningin Elisabeth (GSKE beurs aan V.T. ), de American Muscular Dystrophy Association (MDA onderzoeksbeurs nr. 577497 aan V.T.), en de EU-projecten NEUROMICS (FP7 onder subsidieovereenkomst nr. 2012-305121) en Solve-RD (Horizon 2020 onder subsidieovereenkomst nr. 779257). De UltraView ERS confocale draaischijfmicroscoop en Tecnai G2 Spirit Bio Twin elektronenmicroscoop werden ondersteund door FWO-HERCULES grote infrastructuursubsidies nr. 23714 en nr. 25340. De Seahorse XF HS Mini Analyzer werd ondersteund door de Universiteit Antwerpen Basisonderzoek Infrastructuur subsidie nr. 41438. V.T. en W.D.V. zijn lid van het µNeuro Center of Excellence aan de Universiteit Antwerpen.

Concurrerende belangen

De auteurs melden geen concurrerende belangen.

Aanvullend materiaal

Aanvullend materiaal is beschikbaar op Brain online.

Referenties 

  1. Baets J, De Jonghe P, Timmerman V. Recent advances in Charcot-Marie-Tooth disease. Curr Opin Neurol. 2014;27(5):532–540. Google ScholarCrossrefPubMed
  2. Pisciotta C, Shy ME. Neuropathy. Handbook Clin Neurol. 2018;148:653–665. Google ScholarCrossref
  3. Pareyson D. Axonal Charcot-Marie-Tooth disease: The fog is only slowly lifting. Neurology. 2007;68(20):1649–1650. Google ScholarCrossrefPubMed
  4. Pipis M, Rossor AM, Laura M, Reilly MM. Next-generation sequencing in Charcot–Marie–Tooth disease: Opportunities and challenges. Nat Rev Neurol. 2019;15(11):644–656. Google ScholarCrossrefPubMed
  5. Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006;126(4):663–676. Google ScholarCrossrefPubMed
  6. Juneja M, Burns J, Saporta MA, Timmerman V. Challenges in modelling the Charcot-Marie-Tooth neuropathies for therapy development. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2019;90(1):58–67. Google ScholarCrossrefPubMed
  7. Rossor AM, Polke JM, Houlden H, Reilly MM. Clinical implications of genetic advances in Charcot-Marie-Tooth disease. Nat Rev Neurol. 2013;9(10):562–571. Google ScholarCrossrefPubMed
  8. Juneja M, Azmi A, Baets J, et al.  PFN2 and GAMT as common molecular determinants of axonal Charcot-Marie-Tooth disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2018;89(8):870–878. Google ScholarCrossrefPubMed
  9. Guo W, Naujock M, Fumagalli L, et al.  HDAC6 inhibition reverses axonal transport defects in motor neurons derived from FUS-ALS patients. Nat Commun. 2017;8(1):861- Google ScholarCrossrefPubMed
  10. Chambers SM, Qi Y, Mica Y, et al.  Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nat Biotechnol. 2012;30(7):715–720. Google ScholarCrossrefPubMed
  11. Mahmud M, Pulizzi R, Vasilak E, Giugliano M. QSpike tools: A generic framework for parallel batch preprocessing of extracellular neuronal signals recorded by substrate microelectrode arrays. Front Neuroinform. 2014;8(26). Google Scholar
  12. Schneider CA, Rasband WS, Eliceiri KW. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 2012;9(7):671–675. Google ScholarCrossrefPubMed
  13. Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frise E, et al.  Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 2012;9(7):676–682. Google ScholarCrossrefPubMed
  14. Estrada-Cuzcano A, Martin S, Chamova T, et al.  Loss-of-function mutations in the ATP13A2/PARK9 gene cause complicated hereditary spastic paraplegia (SPG78). Brain. 2017;140(2):287–305. Google ScholarCrossrefPubMed
  15. Jordanova A, De Jonghe P, Boerkoel CF, et al.  Mutations in the neurofilament light chain gene (NEFL) cause early onset severe Charcot-Marie-Tooth disease. Brain. 2003;126(Pt 3):590–597. Google ScholarPubMed
  16. Züchner S, Mersiyanova IV, Muglia M, et al.  Mutations in the mitochondrial GTPase mitofusin 2 cause Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 2A. Nat Genet. 2004;36(5):449–451. Google ScholarCrossrefPubMed
  17. Irobi J, Van Impe K, Seeman P, et al.  Hot-spot residue in small heat-shock protein 22 causes distal motor neuropathy. Nat Genet. 2004;36(6):597–601. Google ScholarCrossrefPubMed
  18. Evgrafov OV, Mersiyanova I, Irobi J, et al.  Mutant small heat-shock protein 27 causes axonal Charcot-Marie-Tooth disease and distal hereditary motor neuropathy. Nat Genet. 2004;36(6):602–606. Google ScholarCrossrefPubMed
  19. Adriaenssens E, Geuens T, Baets J, Echaniz-Laguna A, Timmerman V. Novel insights in the disease biology of mutant small heat shock proteins in neuromuscular diseases. Brain. 2017;140(10):2541–2549. Google ScholarCrossrefPubMed
  20. Saporta MA, Dang V, Volfson D, et al.  Axonal Charcot-Marie-Tooth disease patient-derived motor neurons demonstrate disease-specific phenotypes including abnormal electrophysiological properties. Exp Neurol. 2015;263:190–199. Google ScholarCrossrefPubMed
  21. Alderson TR, Adriaenssens E, Asselbergh B, et al.  A weakened interface in the P182L variant of HSP27 associated with severe Charcot-Marie-Tooth neuropathy causes aberrant binding to interacting proteins. EMBO J. 2021;e103811. Google Scholar
  22. d'Ydewalle C, Krishnan J, Chiheb DM, et al.  HDAC6 inhibitors reverse axonal loss in a mouse model of mutant HSPB1-induced Charcot-Marie-Tooth disease. Nat Med. 2011;17(8):968–974. Google ScholarCrossrefPubMed
  23. Bouhy D, Juneja M, Katona I, et al.  A knock-in/knock-out mouse model of HSPB8-associated distal hereditary motor neuropathy and myopathy reveals toxic gain-of-function of mutant Hspb8. Acta Neuropathol. 2018;135(1):131–148. Google ScholarCrossrefPubMed
  24. Ponomareva OY, Eliceiri KW, Halloran MC. Charcot-Marie-Tooth 2b associated Rab7 mutations cause axon growth and guidance defects during vertebrate sensory neuron development. Neural Dev. 2016;11:2- Google ScholarCrossrefPubMed
  25. Fujimori K, Ishikawa M, Otomo A, et al.  Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent. Nat Med. 2018;24(10):1579–1589. Google ScholarCrossrefPubMed
  26. Perez-Siles G, Cutrupi A, Ellis M, et al.  Energy metabolism and mitochondrial defects in X-linked Charcot-Marie-Tooth (CMTX6) iPSC-derived motor neurons with the p.R158H PDK3 mutation. Sci Rep. 2020;10(1):9262. Google ScholarCrossrefPubMed
  27. Filadi R, Pendin D, Pizzo P. Mitofusin 2: From functions to disease. Cell Death Dis. 2018;9(3):330- Google ScholarCrossrefPubMed
  28. Zhou Y, Carmona S, Muhammad AKMG, et al.  Restoring mitofusin balance prevents axonal degeneration in a Charcot-Marie-Tooth type 2A model. J Clin Invest. 2019;129(4):1756–1771. Google ScholarCrossrefPubMed
  29. Schwartzentruber J, Foskolou S, Kilpinen H, et al. ; HIPSCI Consortium. Molecular and functional variation in iPSC-derived sensory neurons. Nat Genet. 2018;50(1):54–61. Google ScholarCrossrefPubMed
  30. Sleigh JN, Tosolini AP, Gordon D, et al.  Mice carrying ALS mutant TDP-43, but not mutant FUS, display in vivo defects in axonal transport of signaling endosomes. Cell Rep. 2020;30(11):3655–3662.e2. Google ScholarCrossrefPubMed
  31. Fledrich R, Stassart RM, Klink A, et al.  Soluble neuregulin-1 modulates disease pathogenesis in rodent models of Charcot-Marie-Tooth disease 1A. Nat Med. 2014;20(9):1055–1061. Google ScholarCrossrefPubMed
  32. Hinchy EC, Gruszczyk AV, Willows R, et al.  Mitochondria-derived ROS activate AMP-activated protein kinase (AMPK) indirectly. J Biol Chem. 2018;293(44):17208–17217. Google ScholarCrossrefPubMed
  33. Ballard-Croft C, Kristo G, Yoshimura Y, et al.  Acute adenosine preconditioning is mediated by p38 MAPK activation in discrete subcellular compartments. Am J Physiol - Hear Circ Physiol. 2005;288(3):H1359-H1366. Google ScholarCrossref
  34. Wall JA, Wei J, Ly M, et al.  Alterations in oxidative phosphorylation complex proteins in the hearts of transgenic mice that overexpress the p38 MAP kinase activator, MAP kinase kinase 6. Am J Physiol - Hear Circ Physiol. 2006;291(5):H2462–2472. Google ScholarCrossref
  35. Summers DW, Frey E, Walker LJ, Milbrandt J, DiAntonio A. DLK activation synergizes with mitochondrial dysfunction to downregulate axon survival factors and promote SARM1-dependent axon degeneration. Mol Neurobiol. 2020;57(2):1146–1158. Google ScholarCrossrefPubMed
  36. Horiuchi D, Collins CA, Bhat P, et al.  Control of a kinesin-cargo linkage mechanism by JNK pathway kinases. Curr Biol. 2007;17(15):1313–1317. Google ScholarCrossrefPubMed
  37. Le Pichon CE, Meilandt WJ, Dominguez S, et al.  Loss of dual leucine zipper kinase signaling is protective in animal models of neurodegenerative disease. Sci Transl Med. 2017;9(403):eaag0394. Google ScholarCrossrefPubMed
  38. Pozniak CD, Ghosh AS, Gogineni A, et al.  Dual leucine zipper kinase is required for excitotoxicity-induced neuronal degeneration. J Exp Med. 2013;210(12):2553–2567. Google ScholarCrossrefPubMed
  39. Beijer D, Sisto A, Van Lent J, Baets J, Timmerman V. Defects in axonal transport in inherited neuropathies. J Neuromuscul Dis. 2019;6(4):401–419. Google ScholarCrossrefPubMed
  40. Grimm A, Cummins N, Götz J. Local oxidative damage in the soma and dendrites quarantines neuronal mitochondria at the site of insult. iScience. 2018;6:114–127. Google ScholarCrossrefPubMed
  41. Ashrafi G, Schlehe JS, LaVoie MJ, Schwarz TL. Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin. J Cell Biol. 2014;206(5):655–670. Google ScholarCrossrefPubMed
  42. Sheng ZH. The interplay of axonal energy homeostasis and mitochondrial trafficking and anchoring. Trends Cell Biol. 2017;27(6):403–416. Google ScholarCrossrefPubMed
  43. Krols M, van Isterdael G, Asselbergh B, et al.  Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration. Acta Neuropathol. 2016;131(4):505–523. Google ScholarCrossrefPubMed
  44. Bernard-Marissal N, van Hameren G, Juneja M, et al.  Altered interplay between endoplasmic reticulum and mitochondria in Charcot-Marie-Tooth type 2A neuropathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019;116(6):2328–2337. Google ScholarCrossrefPubMed
  45. Rabinovitch RC, Samborska B, Faubert B, et al.  AMPK maintains cellular metabolic homeostasis through regulation of mitochondrial reactive oxygen species. Cell Rep. 2017;21(1):1–9. Google ScholarCrossrefPubMed
  46. Benoy V, Van Helleputte L, Prior R, et al.  HDAC6 is a therapeutic target in mutant GARS-induced Charcot-Marie-Tooth disease. Brain. 2018;141(3):673–687. Google ScholarCrossrefPubMed
  47. Kalinski AL, Kar AN, Craver J, et al.  Deacetylation of Miro1 by HDAC6 blocks mitochondrial transport and mediates axon growth inhibition. J Cell Biol. 2019;218(6):1871–1890. Google ScholarCrossrefPubMed
  48. López-Doménech G, Higgs NF, Vaccaro V, et al.  Loss of dendritic complexity precedes neurodegeneration in a mouse model with disrupted mitochondrial distribution in mature dendrites. Cell Rep. 2016;17(2):317–327. Google ScholarCrossrefPubMed
  49. Wilkinson S. Emerging principles of selective ER autophagy. J Mol Biol. 2020;432(1):185–205. Google ScholarCrossrefPubMed
  50. Hübner CA, Dikic I. ER-phagy and human diseases. Cell Death Differ. 2020;27(3):833–842. Google ScholarCrossrefPubMed

CMT - Charcot-Marie-Tooth
DLK - dual leucine kinase
iPSC - induced pluripotent stem cell

© De auteur(s) (2021). Gepubliceerd door Oxford University Press namens de Garanten van het Brein.

Dit is een Open Access artikel verspreid onder de voorwaarden van de Creative Commons Naamsvermelding Niet-Commerciële Licentie (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/), die niet-commercieel hergebruik, distributie en reproductie in elk medium toestaat, mits het originele werk goed geciteerd wordt. Voor commercieel hergebruik, neem dan contact op met journals.permissions@oup.com

Aanvullende gegevens 

awab226_Supplementary_Data - zip-bestand

doi:10.1093/brain/awab226

Figuren waarvan sprake in dit vertaald verslag

De figuren waarvan sprake in het verslag zijn terug te vinden in de originele, Engelstalige versie.

Vertaling onderschriften: Klik hier.