Generatie en karakterisering van CMT2 iPSC's
Een bijzondere uitdaging bij het gebruik van iPSC's voor het bestuderen van een genetisch diverse ziekte zoals CMT komt niet alleen voort uit verschillen tussen genetische varianten, maar ook uit verschillen die ontstaan door de ontwikkeling van iPSC's in verschillende laboratoria. In dit opzicht, en met de huidige technologie kan eenzelfde mutatie die in twee verschillende laboratoria is gegenereerd, zeer verschillende experimentele resultaten opleveren. Dit is een belemmering geweest voor de identificatie van gedeelde moleculaire tekorten tussen verschillende CMT2 subtypes. Om deze grote uitdaging te overwinnen, genereerden wij iPSC lijnen van vijf verschillende CMT2 mutaties samen met twee gezonde controles (Fig. 1A, B en Supplementaire Tabel 1) tegelijkertijd en binnen dezelfde onderzoeksomgeving. In deze studie hebben we ons gericht op de volgende genmutaties die de respectievelijke gemeenschappelijke CMT2 subtypes vertegenwoordigen: MFN2R94Q (CMT2A), NEFLP8R (CMT2E), HSPB8K141N (CMT2L), HSPB1G84R (CMT2F) en HSPB1P182L (CMT2F). Deze geselecteerde genen en hun respectievelijke mutaties omvatten de meest voorkomende vormen van axonale CMT die tot op heden geïdentificeerd zijn.15-18
Om rekening te houden met mogelijke variabiliteit, bevat deze lijst ook twee verschillende mutaties in hetzelfde gen (HSPB1G84R en HSPB1P182L) met verschillende ernst van de ziekte en die invloed hebben op verschillende eiwitdomeinen van HSPB1.19 De herprogrammering van fibroblasten werd uitgevoerd met behulp van een Sendai-virus, bestaande uit vier herprogrammering factoren (Oct4, Sox2, Klf4 en cMyc). Pluripotentie werd bevestigd door immunokleuring voor Nanog, Oct4, SSEA4, Sox2, Tra 1-60 en Tra 1-81 (Supplementary Fig. 1A). Een kwantitatieve analyse van zelfvernieuwing en drie-fase differentiatie potentieel (TaqManVR hPSC ScorecardTM assay) werd uitgevoerd (Aanvullende Fig. 1B). Bovendien, alle iPSC lijnen toonden pluripotente stamcel markers weergegeven door RT-qPCR voor Oct4, Sox2 en Nanog (Supplementary Fig. 1C). De afwezigheid van de relatieve virale expressie van Sendai en c-Myc werd bevestigd door RTqPCR (Supplementary Fig. 1D). Verdere karakterisering werd uitgevoerd door DNA vingerafdrukken, die identieke single nucleotide polymorfisme profielen lieten zien met het corresponderende fibroblast monster (Supplementaire tabel 2). Ten slotte, om rekening te houden voor potentiële variabiliteit, genereerden we een isogene controlelijn waarin de MFN2R94Q mutatie (MFN2ISO) werd gered met behulp van de CRISPR / Cas9 Gen editing-technologie (Fig. 1B en Supplementary Fig. 8A). Samen moet deze reeks iPSC-lijnen de nodige instrumenten verschaffen om natuurlijke variabiliteit te filteren en moleculaire veranderingen te identificeren die werkelijk van de ziekte afstammen.
Differentiatie van iPSC's naar motorneuronen
Differentiatie van iPSCs tot motorneuronen was gebaseerd op een eerder gepubliceerd protocol.9 De verschillende in vivo neuronale ontwikkelingsstadia werden gesimuleerd door toevoeging van kleine moleculen in vitro (Fig. 1C). Dit protocol, in combinatie met een enkele behandeling met AraC op dag 14, zorgde voor een hoge zuiverheid motor neuron culturen. Immunokleuring onthulde dat alle iPSC-afgeleide motor neuronen positief waren voor MAP2, Islt1 en ChAT (Fig. 1D). Bovendien toonde RT-qPCR een toename aangetoond in de relatieve expressie van ChAT en HB9 in de tijd van iPSC kolonies (Dag 0) tot volwassen motorneuronen (Supplementaire Fig. 1E). Geen significante verschillen tussen volwassen patiënt lijnen en controles werden waargenomen. Bovendien, de isogene MFN2ISO lijn was ook in staat om succesvol te differentiëren in motorische neuronen. Deze patiënt en controle iPSC-afgeleide motor neuron lijnen werden gebruikt in deze studie om gemeenschappelijke kenmerken te zoeken die gezonde van axonale CMT ziekte fenotypes onderscheidden.
Om onze lijnen te kenmerken, onderzochten we eerst of we eerder gerapporteerde gen-specifieke fenotypes zouden waarnemen voor bepaalde CMT2 subtypes. Bijvoorbeeld, mutaties in het neurofilament lichte keten gen (NEFL), dat CMT2E veroorzaakt, verstoren de samenstelling van het intermediaire filament netwerk, door ophoping in de perikarya en neurieten in het bijzonder.20 Wij waren in staat om de lichte neurofilament (NF-L) inclusies te valideren in zowel het cellichaam als in de neurieten van CMT2E-afgeleide motorneuronen door het uitvoeren van immunokleuring voor NF-L op dag 37 (Supplementaire Fig. 2A). Geblindeerde kwantificering onthulde een significante toename van NF-L vergeleken met gezonde controles, gebruik makend van NF-L signaal drempels (het totale gebied van NF-L insluitsels gedeeld door een achtergrond van NF-L kleuring) (Supplementaire Fig. 2B). Bovendien werden filamenteuze ophopingen bevestigd door ultrastructurele analyse van de NEFLP8R motorneuronlijn (Aanvullende Fig. 2C). Een tweede voorbeeld van een gen-specifiek fenotype is de vorming van HSPB1-positieve aggregaten als gevolg van Cterminale HSPB1 mutaties.21 We valideerden de aanwezigheid van HSPB1 aggregaten in onze iPSC-afgeleide motorneuronen van de HSPB1P182L lijn, met behulp van immunokleuring op dag 37 voor HSPB1 (Supplementary Fig. 3A). Terwijl er geen aggregaten werden gezien voor de N-terminale HSPB1G84R mutatie, bevatte een deel van de HSPB1P182L cellen grote cytoplasmatische aggregaten (Supplementary Fig. 3A). Bovendien bevestigden we een bekende vermindering in a-tubuline acetylatie niveaus voor de HSPB1P182L patiëntenlijn, voor het eerst gerapporteerd in een CMT2F muismodel (Supplementaire Fig. 3B).22 Ten slotte hebben we een afname gerecapituleerd in BAG3 niveaus in iPSC-afgeleide motorneuronen voor de HSPB8K141N mutatie (Supplementaire Fig. 4), een bevinding die is waargenomen en door ons is waargenomen en gerapporteerd in de heupzenuw van 12 maanden oude symptomatische Hspb8K141N/K141N knock-in muizen en weerspiegelt veranderingen in autofagie.23 Concluderend, deze CMT2-afgeleide motorneuronen recapituleren eerder beschreven gen-specifieke veranderingen. Het blijft echter onduidelijk wat deze verschillende CMT2 subtypes verbind.
CMT2 motor neuronen vertonen neuriet netwerk tekorten met veranderde extracellulaire elektrofysiologische eigenschappen
Aangezien veranderingen in het neurietnetwerk werden gerapporteerd in iPSC afgeleide neuronale modellen en in diermodellen van perifere neuropathieën,24,25 trachtten wij na te gaan of een afname in het neurietnetwerk een gemeenschappelijk fenotype zou zijn in onze CMT2 iPSC afgeleide motorneuronen. We pasten twee methoden toe om dit te onderzoeken. Ten eerste analyseerden we fase-contrast beelden van neuronale culturen op dagen 38-50 met behulp van pixel classificatie om het aantal neurieten en cellichamen te segmenteren en te meten (Fig. 2A en B). Aanvullend hierop bestudeerden we het neuronale netwerk op Dagen 25-30 door middel van geautomatiseerde fluorescentie confocale microscopie met hoge doorvoer (Fig. 2C). Van alle iPSC-afgeleide motor neuron lijnen, hadden de twee controlelijnen gemiddeld het dichtste neurietnetwerk in beide soorten analyses. Met een gelijk aantal cellen na 25- 30 dagen (Fig. 2D), werd een statistisch significante afname in neuriet lengte gevonden voor de MFN2R94Q en NEFLP8R lijnen (Fig. 2E). Deze suggereerde dat CMT2 mutaties een negatieve invloed hebben op het neurietnetwerk van iPSC-afgeleide motorneuronen.
Om te onderzoeken of deze kleine veranderingen in het neuriet netwerk gekoppeld waren aan veranderingen in neuronale activiteit, voerden we microelectrode serie experimenten uit. De spontane elektrische activiteit van iPSC-afgeleide motorneuronen werd opgenomen met een bemonsteringsfrequentie van 25 kHz tijdens verschillende ontwikkelingsstadia. Representatieve sporen die werden verzameld over een 300 s opname periode worden getoond en werden gekenmerkt door geïsoleerde en periodieke collectieve gepiekte gebeurtenissen (Fig. 2F). Analyse van de sporen gaven veranderingen aan in de uitbarstingssnelheid voor alle CMT2-afgeleide motorneuronen in vergelijking met de controles (Fig. 2G). De MFN2R94Q en NEFLP8R lijnen toonden een toename van de uitbarstingssnelheid, wat hyper-connectiviteit suggereert. In tegenstelling, de Hitteschok proteïne mutanten (HSPB8K141N, HSPB1G84R en HSPB1P182L) vertoonden een tendens naar een afname van uitbarstingssnelheid, wat wijst op een hypo-connectiviteitstoestand. Hoewel genspecifieke verschillen de tegengestelde trends tussen de verschillende CMT2 subtypes kunnen verklaren, kunnen veranderingen in beide richtingen bijdragen tot neuronale en axonale degeneratie.9,20
Progressief axonaal transport en morfologische tekorten in CMT2-afgeleide motor neuronen
Eerdere studies hebben axonale transportdefecten gerapporteerd, zoals verminderde mitochondriale snelheid in iPSC-afgeleide neuronen van CMT2A, CMT2E of CMTX6.20,26 Het blijft echter onbekend of deze kenmerken van axonale degeneratie gemeenschappelijk zijn voor alle CMT2 subtypes. Om na te gaan of dit op zijn minst een gemeenschappelijk kenmerk was in onze vijf CMT2 lijnen, voerden we live-cel beeldvormingsexperimenten uit om mitochondriale en lysosomale verkeer in zowel controle en patiënt iPSC-afgeleide motorneuronen in de tijd met behulp van MitoTrackerTM en LysoTrackerTM kleurstoffen, respectievelijk. We zagen een significante afname van de mitochondriale snelheid in alle van patiënten afgeleide motorneuronen op dagen 38-50 (Fig. 3A), terwijl op dagen 22-28, alleen de MFN2R94Q motor neuronen een afname in mitochondriale snelheid toonden (Aanvullende Fig. 5A). Het percentage van de bewegende mitochondriën was niet significant verschillend; echter, op Dagen 22-28 zagen we een significante afname in de MFN2R94Q patiënt lijn (Supplementary Fig. 5A). Vergelijkbaar met de mitochondriale snelheid, was de lysosomale snelheid significant afgenomen in alle patiënten motorneuronen op Dagen 38- 50 (Fig. 3B), terwijl op Dagen 22-28, de MFN2R94Q, NEFLP8R en HSPB8K141N motorneuronen een trend vertoonden in de richting van een afname van lysosomale snelheid (Supplementaire Fig. 5B). Bovendien werd het percentage van de bewegende lysosomen aanzienlijk verminderd op dagen 38-50 (Supplementaire Fig. 5B). Deze live-cel beeldvorming experimenten toonden aan dat axonale transport in het algemeen werd belemmerd en mitochondriale en lysosomale verkeer verslechterde in de tijd.
Gezien de nauwe band tussen mitochondriale functionaliteit en vorm, bestudeerden we het effect van CMT2 mutaties op de mitochondriale vorm (Fig. 3C). Voor MFN2 mutaties, is het al bekend dat fusie is verstoord, waardoor mitochondriale fragmentatie optreedt.27,28 Echter, voor de andere CMT2 mutanten, is dit nog niet systematisch onderzocht. Om na te gaan of veranderingen in de mitochondriale morfologie een ander gemeenschappelijk kenmerk zouden kunnen vormen, analyseerden wij de mitochondriale vormparameters in motor neuron culturen gelabeld met MitoTrackerTM kleurstof. Onze gegevens onthulden verminderde mitochondriale rek, met een toename in circulariteit (Fig. 3D) en een afname in aspect ratio (Fig. 3E) in alle van de patiënt afgeleide motor neuronen tussen 38 en 50 dagen. Interessant is dat voor de MFN2R94Q en NEFLP8R gemuteerde motorneuronen, dit reeds waarneembaar was op Dagen 22-28 (Aanvullende Fig. 6A en B). Veranderingen in de mitochondriale morfologie voor de MFN2R94Q en NEFLP8R mutant motor neuronen werden verder bevestigd door transmissie elektronen microscopie op Dag 25 Supplementary Fig. 6C en D). Al met al, toonden onze resultaten een progressief aangetast axonaal transport en gefragmenteerde mitochondriale morfologie in alle patiënten lijnen.
Motor neuron-specifieke subtypes van CMT2 hebben geen beïnvloeden iPSC-afgeleide sensorische neuronen
Aangezien de MFN2R94Q en NEFLP8R CMT2 patiënten zowel motorische en sensorische symptomen vertoonden (Supplementaire Tabel 1), onderzochten we of deze mutaties ook de sensorische neuronen beïnvloedden. Daarom hebben we iPSCs gedifferentieerd in perifere sensorische neuronen met behulp van een eerder gepubliceerd protocol 10 (Fig. 4A), die een heterogene sensorische neuronale cultuur produceerde.29 Immunokleuring op dag 37 bleek dat alle iPSC-afgeleide sensorische neuronen positief waren voor Beta-III-Tub, BRN3A en TRPV1 (Fig. 4B). Eerst gingen we na of gen-specifieke fenotypes gereproduceerd werden in iPSC-afgeleide sensorische neuronen. We zagen dat NF-L ophopingen ook aanwezig waren in patiënten iPSC-afgeleide sensorische neuronen, zoals blijkt uit een significante toename van NF-L inclusies in de perikarya en neurieten van de NEFLP8R patiënt lijn op Dag 37 (Supplementaire Fig. 2D-E). Voor HSPB1P182L, zagen we alleen een daling van a-tubuline acetylering in iPSC-motor neuronen, maar niet iPSC sensorische neuronen op Dag 37 (Supplementaire Fig. 3C), die in overeenstemming was in lijn met de overheersende motor neuron fenotype in dit type van CMT2 genmutatie. We hebben ook de neuriet lengte gemeten in deze iPSC-afgeleide sensorische neuronen op fase contrast beelden van levende niet-gekleurde neuronen, op dezelfde manier als voor de motor neuronen. Een significante afname in neuriet lengte trad op dagen 38-50 in de MFN2R94Q en NEFLP8R sensorische neuron lijnen (Fig. 4C).
Vervolgens hebben we axonaal transport gemeten met MitoTrackerTM en LysoTrackerTM voor het labelen van respectievelijk deitochondria en de lysosomen. Kymograph analyse toonde een significante vermindering op dagen 38-50 in de mitochondriale en lysosomale snelheden voor de MFN2R94Q en NEFLP8R sensorische neuron lijnen (Fig. 4D). Bovendien werd een verminderd aantal bewegende mitochondriën en lysosomen waargenomen in deze twee patiënten lijnen in vergelijking met zowel de controles (Fig. 4D). We vonden ook dat de mitochondriale vorm in de MFN2R94Q en NEFLP8R sensorische neuronen, vergelijkbaar met motor neuronen, een afname van de aspect ratio (Fig. 4E) onthuld. Merk op dat de snelheid distributie van mitochondriale en lysosomale verkeer duidelijk verschilde tussen de motor en sensorische neuronen: axonale transport snelheden waren significant hoger in de motor neuronen in vergelijking met de sensorische neuronen van gezonde controles (Supplementary Fig. 7A-D). Dit was in lijn met in vivo gegevens waarin axonale verkeer van signalering endosomen aanzienlijk sneller was in motor versus sensorische neuronen van ChAT-eGFP muizen.30 Deze verschillen in snelheid zouden kunnen voortvloeien uit verschillen in de axon dikte tussen motorische en sensorische neuronen. Gecombineerd suggereerden onze resultaten dat neurietlengte, axonaal transport en mitochondriale vorm met name verstoord waren in iPSC afgeleide sensorische neuronen van CMT2 patiënten met sensorische symptomen, terwijl de sensorische neuronen van CMT2 subtypes met een overwegend motorisch-fenotype (HSPB1G84R, HSPB1P182L en HSPB8K141N) onverschillig waren van controle iPSC-afgeleide sensorische neuronen.
Het corrigeren van de MFN2R94Q mutatie met behulp van gen-editing herstelt ziekte fenotypes
In deze studie hebben we axonale degeneratie kenmerken waargenomen in gedifferentieerde motorische en sensorische neuronen van de MFN2R94Q patiënt iPSC lijn. We pasten CRISPR / Cas9 toe om de pathogene MFN2R94Q patiënt iPSC lijn naar een gecorrigeerde MFN2ISO lijn te genereren (Fig. 1B en Aanvullende Fig. 8A) en te beoordelen of de correctie de karakteristieke ziektefenotypen herstelt in motorische en sensorische neuronen. Hieruit bleek dat correctie van de MFN2R94Q mutatie neuriet lengte herstelde in iPSC-afgeleide motorische en sensorische neuronen (Supplementaire Fig. 8B, C en G). Ook de verstoringen in de extracellulaire elektrofysiologische eigenschappen werden gecorrigeerd, zoals aangetoond door een herstel van de uitbarstingssnelheid (Supplementary Fig. 8D). De gefragmenteerde mitochondriale morfologie en de veranderde mitochondriale en lysosomale verkeer op dagen 38-50 werden eveneens gecorrigeerd in zowel iPSC-afgeleide motorische en sensorische neuronen afgeleid van de MFN2ISO lijn (Supplementary Fig. 8E, F, H en I). Samengevat, de isogene MFN2ISO lijn herstelde de ziekte fenotype van de MFN2R94Q patiënt lijn, waaruit blijkt dat onze resultaten in iPSC afgeleide motorische en sensorische neuronen echte kenmerken van CMT2A zijn.
Veranderd mitochondriaal expressieprofiel in iPSC-afgeleide motorneuronen van CMT2
Om globaal het transcriptomische profiel af te bakenen tussen de twee gezonde controle en vijf CMT2 patiënt iPSC-afgeleide motorneuronen, voerden we bulk RNA-sequencing uit op dag 50 afgeleide motorneuronen. Principale componenten analyse (PCA) toonde aan dat de axonale CMT monsters afzonderlijk van de controles geclusterd waren (Supplementary Fig. 9A). In het transcriptoom van de vijf verschillende CMT2 patiënt-afgeleide motorneuronen, kwamen 2846 genen differentieel tot expressie in vergelijking met beide controles (Fig. 5A). We gebruikten RT-qPCR om enkele van de meest voorkomende differentieel tot expressie komende genen (NKX6-1, CNTN4 en KHDRBS2) te valideren, hetgeen de differentiële expressie van deze transcripten tussen de CMT2 lijnen en de controles bevestigde (Fig. 5B). Om gen-specifieke versus gedeelde differentieel tot expressie komende transcripten te onderscheiden, voerden wij een Venn diagram analyse uit (Fig. 5C). Dit stelde ons in staat om de overlap tussen elk van de CMT2 patiënt motor neuron lijnen te analyseren en een kernprofiel van 740 transcripten te identificeren die werden gedeeld door alle CMT2 genmutaties. Ontologie van genen (GO) analyse van deze gemeenschappelijke differentieel tot expressie komende genen identificeerde verrijkte cellulaire component GO termen zoals 'ademhalingsketen' en 'axon' (Supplementary Fig. 9BandC). Bovendien vonden we in de top geassocieerde verrijkte routes 'axon geleiding route' en de 'PI3K-Akt signalering route' (Supplementary Fig. 9C). Van deze laatste route werd ook aangetoond dat ze onevenwichtig is in CMT knaagdiermodellen.31
Eén van de top treffers was de 'ademhalingsketen', die dit kernprofiel van verschillend geëxpresseerde genen linkt aan de mitochondriën. We bevestigden dit met een bijkomende PCA, waaruit bleek dat gezonde controles en CMT2 stalen afzonderlijk geclusterd waren wanneer enkel de mitochondriaal gecodeerde genen geanalyseerd werden (Fig. 5E). Dit was in overeenstemming met onze eerdere resultaten die aantoonden dat mitochondriaal transport en morfologie zijn aangetast in alle CMT2 patiënt iPSC lijnen. Om een connectiviteitsnetwerk te construeren van de verschillend tot expressie komende genen die ten grondslag liggen aan de top treffers in de 'ademhalingsketen' term, voerden we GeneMANIA gen netwerk clustering uit (Fig. 5D) en dit toonde aan dat veel van de treffers onderling verbonden waren op meerdere niveaus, variërend van directe proteïne-eiwit interacties tot eiwitten van dezelfde route, verder onderstrepend hoe verschillende CMT2 genen dezelfde mitochondriale processen kunnen ontregelen.
Motorneuronen gegenereerd uit CMT2 patiënten hebben een veranderd bio-energetisch profiel
Onze resultaten tot hiertoe toonden aan dat mitochondriaal transport en morfologie ontregeld waren en dat dit kenmerk gemeenschappelijk was voor alle CMT2 motor neuron lijnen gebruikt in deze studie. Het is dan ook niet verwonderlijk dat 'PI3K-Akt signalering' en 'ademhalingsketen' werden geïdentificeerd als geassocieerde GO termen in onze transcriptomische analyse, wat aangeeft dat mitochondriale disfunctie zou kunnen worden waargenomen door cytosolische stress integratoren zoals Akt en AMPK. Daarom gingen we na of de Akt en AMPK fosforylering niveaus verschillend waren in de CMT2 lijnen versus de controles. Dit bevestigde een duidelijke toename van gefosforyleerde Akt en AMPK in alle CMT2 patiënten lijnen (Fig. 6A). Om na te gaan of deze in vitro bevindingen zich ook zouden uitstrekken tot in vivo modellen, isoleerden we de heupzenuw van 1-jarige symptomatische Hspb8K141N/K141N muizen die CMT2L modelleren. Vergelijkbaar met onze waarnemingen in de iPSC-motorneuronen, vonden we een toename van gefosforyleerde Akt en AMPK in de nervus ischiadicus (Fig. 6B). Aangezien de heupzenuw niet uitsluitend bestaat uit motorneuronen, maar ook andere celtypes bevat zoals Schwann cellen, fibroblasten en endotheelcellen, blijft het werkelijke effect op de motorneuronen mogelijk onderschat.
Aangezien AMPK een bekende sensor is voor het cellulaire energiemetabolisme,32 onderzochten we of deze CMT2 mutaties tekortkomingen zouden vertonen in de oxidatieve fosforylering. We onderzochten de mitochondriale ademhaling met behulp van een Seahorse analyser en beoordeelden de mitochondriale functie met de Cell Mito Stress Test assay (Fig. 6C). Metingen van de mitochondriale basale ademhaling op Dagen 38-39 toonden een afname in de MFN2R94Q, NEFLP8R, HSPB8K141N en HSPB1P182L patiënt lijnen (Fig. 6D), die samenviel met de veranderde mitochondriale vorm (Supplementary Fig. 6A en B) en verminderd mtDNA kopie aantal (Supplementary Fig. 11) waargenomen op dit tijdstip. Op 24-25 dagen, een daling van de basale ademhaling en aangetaste mitochondriale morfologie kon al worden waargenomen in de MFN2R94Q en NEFLP8R patiënt motor neuron lijnen (Supplementary Fig. 6A, B, D en Supplementary Fig. 10A). Ten slotte hebben we ook aangetoond dat de isogene MFN2ISO lijn in staat was om defecte oxidatieve fosforylering in de MFN2R94Q patiënt lijn te herstellen, zowel in vroege en late tijdstip experimenten (Supplementary Fig. 10 B en C).
DLK inhibitie verbetert mitochondriale dysfunctie in motor neuronen gegenereerd uit CMT2A en CMT2E patiënten
Aangezien onze gegevens aantoonden dat mitochondriale disfunctie een gemeenschappelijk kenmerk was in onze CMT2 lijnen en dat stress routes die hierop een invloed hebben overgeactiveerd zijn, wilden we onderzoeken of het moduleren van deze stress routes een aantal van de ziekte-geassocieerde fenotypes zou kunnen verbeteren. Aangezien MAPK's zich direct en indirect kunnen richten op mitochondria,33,34 onderzochten we of we deze stress-geïnduceerde transcriptionele veranderingen konden aanpakken (Fig. 7A) met behulp van een DLK (ook bekend als MAP3K12) remmer. DLK werkt stroomopwaarts van de stress-responsieve c-Jun N-terminal kinase (JNK) route (een lid van de MAPK eiwit familie) en wordt sterk uitgedrukt in neuronale cellen. Bovendien versterken mitochondriale disfunctie en DLK activatie elkaar in het induceren van axonale schade.35 Bovendien zijn DLK en, in zekere mate, de JNK route ook nauw betrokken bij axonaal organel transport.36 Deze DLK remmer bevindt zich momenteel in een fase I klinische studie voor amyotrofe laterale sclerose (NCT02655614), omdat is aangetoond dat het niet alleen de activatie van JNK vermindert, maar ook de denervatie vertraagt bij de neuromusculaire juncties van SOD1G93A muizen.37 Bovendien wordt het verlies van DLK goed verdragen.38 We richtten ons op de MFN2R94Q en NEFLP8R patiënt motorneuron lijnen, omdat beide de meest ernstig gewijzigde mitochondriale fenotype vertonen, en behandelden de motorneuronen met 1 µM van DLK remmer vanaf dag 11. Om het effect van de behandeling te valideren, werden de totale c-Jun niveaus gemeten en de toename van deze niveaus in de MFN2R94Q en NEFLP8R patiënt motorneuronen lijnen daalde bij remming door DLK (Fig. 7B). Om te bepalen of een dergelijke vermindering van stress signalering zou een positieve invloed op de mitochondriale functionaliteit hebben, behandelden we de motor neuronen met de DLK-remmer en beoordeelde de mitochondriale morfologie, mitochondriale ademhaling en mitochondriaal transport op dagen 38-50 (Fig. 7C-E). Deze experimenten toonden aan dat DLK remming leidde tot een toename van de mitochondriale aspect ratio en basale respiratie in zowel de MFN2R94Q en NEFLP8R lijnen. Bovendien, hoewel niet significant, leidde het tot een lichte toename van de mitochondriale transportsnelheid en het percentage bewegende mitochondriën. Deze resultaten toonden aan dat DLK remming in staat was om mitochondriale disfunctie gedeeltelijk te redden, wat zijn brede therapeutische potentieel aantoont, en dat het richten van dergelijke gedeelde routes de weg zou kunnen effenen voor een universele CMT2 behandeling.
