Modellering van de ziekte van Charcot-Marie-Tooth in een schotel onthult gemeenschappelijke celtype-specifieke veranderingen

September 2021 - Met dank aan Jori voor de vertaling, Spierziekten Vlaanderen

De ziekte van Charcot-Marie-Tooth (CMT) is een van de meest voorkomende geërfde neurologische aandoeningen (~1 op 2500) en kan veroorzaakt worden door mutaties in meer dan 100 nucleaire genen.1 Terwijl CMT leidt tot afwijkingen in zowel zintuigelijke als motorische zenuwen, zijn het bij de erfelijke motorische neuropathieën (dHMN) en de erfelijke sensorische en automatische neuropathieën respectievelijk de motorische neuronen die worden aangetast. Er is echter een overlapping tussen deze condities.

Mitochondriën zijn essentieel voor de gezondheid en levensvatbaarheid van zowel motorische als sensorische neuronen en hun axonen. Processen die de distributie en het transport van mitochondriën langs axonen verstoren, zullen waarschijnlijk aanleiding geven tot perifere neuropathieën. Axonaal transport van mitochondriën is uitgebreid bestudeerd in een reeks muismodellen van CMT, samen met veranderingen in de neurietnetwerken en neuronale exciteerbaarheid. Voor de meeste CMT-veroorzakende genen zijn muismodellen gegenereerd die hebben bijgedragen tot de ontdekking van een aantal pathomechanismen die aan de basis liggen van deze aandoening.2

Meer recentelijk is het genereren van uit patiënten afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcellijnen (iPSC) en hun differentiatie in minder toegankelijke celtypes zoals neuronen een gevestigde benadering geworden voor het bestuderen van ziektemechanismen. Sinds 2015, zijn er verschillende studies gepubliceerd waar CMT afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcellijnen zijn afgenomen van fibroblasten van patiënten of mononucleaire cellen van perifeer bloed.3-6

Deze iPSC's werden voornamelijk gedifferentieerd in motorneuronen of neurale kraakbeencellen, en elke publicatie richtte zich slechts op één gen. In dit nummer van Brain, presenteren Van Lent en medewerkers7 de eerste studie waarin naar meerdere CMT-veroorzakende genen werd gekeken en waarin men probeerde de iPSC’s in meer dan één celtype te differentiëren. Deze aanpak kan helpen onthullen welke aspecten van het pathomechanisme gen- of mutatie-specifiek zijn en welke gemeenschappelijk zijn aan alle types van CMT. Deze informatie zal uiteindelijk van essentieel belang zijn voor de ontwikkeling van therapieën voor CMT, die meerdere CMT-subtypes kan omvatten.

Van Lent et al.7 genereerden iPSC- lijnen van patiënten met vijf verschillende CMT2-mutaties-MFN2R94Q, NEFLP8R, HSPB8K14N, HSPB1G84Ren HSPB1P182L-waaronder diegene die de meest voorkomende axonale vormen van de aandoening veroorzaken, alsook van twee gezonde controles.

Een isogene controlelijn werd ook gegenereerd door correctie van de MFN2R94Q mutatie via CRISPR/Cas9 mutagenese, waardoor natuurlijke variabiliteit kon worden uitgefilterd. Alle iPSC- lijnen werden gedifferentieerd in iPSC-afgeleide motorneuronen en sensorische neuronen.

Na bevestiging van eerder gepubliceerde gen- en mutatie specifieke kenmerken in van patiënten afgeleide motorneuronen (zoals neurofilament lichte insluitsels in de NEFL-gemuteerde motorneuronen), richtten Van Lent en collega's7 hun aandacht op het identificeren van pathogene gemeenschappelijke kenmerken van verschillende CMT2- vormen. Alle CMT2- mutaties verminderden de lengte van neurieten en de neurietdichtheid in motorische neuronen. Bovendien veranderden alle mutaties de spontane elektrische activiteit van motorische neuronen, zij het dat niet alle mutaties resulteerden in hetzelfde type van verandering. Terwijl motorneuronen met MFN2 en NEFL-mutaties een verhoging van de burst-snelheid vertoonden, leidden de andere mutaties tot een afname van de activiteit.

Eerdere studies hebben aangetoond dat het mitochondriale transport langs axonen bij sommige vormen van CMT voorkomt, maar het is onduidelijk of dit gemeenschappelijk is voor alle CMT-subtypes. Door het meten van mitochondriale en lysosomale transporten in controle en patiënt-afgeleide motorneuronen, toonden Van Lent et al.7 aan dat de bewegingssnelheid van mitochondriën en lysosomen verminderd was in alle patiëntencellen. Bovendien werden veranderingen in de vorm van de mitochondriën (verminderde rek) gezien in alle van patiënten afgeleide motorneuronen en waren het meest uitgesproken in de MFN2 en NEFL gemuteerde cellen.

Van Lent et al.7 differentieerden ook dezelfde patiënten iPSC- lijnen in perifere sensorische neuronen, en ontdekten dat neurietlengte en mitochondriale en lysosomale transport alleen werden aangetast in de MFN2- en NEFL- gemuteerde sensorische neuronen. Dit is in overeenstemming met de klinische bevinding dat HSPB- genmutaties voornamelijk motorische neuronen bij patiënten beïnvloeden, terwijl MFN2 en NEFL varianten zowel motorische als sensorische symptomen veroorzaken. Deze reproductie van celtypespecifieke bevindingen in de iPSC-afgeleide motorische en sensorische neuronen helpt iPSC-afgeleide neuronen te valideren als een ziektemodel.

In een transcriptomische analyse identificeerden de auteurs trajecten die gerelateerd zijn aan de mitochondriale ademhalingsketen als verminderd in gemuteerde motorneuronen. In overeenstemming met deze bevindingen op RNA-niveau, vertoonden alle van patiënten afgeleide motorneuronlijnen ook een verminderd zuurstofverbruik, gemeten met een Seahorse Analyzer. Verminderd zuurstofverbruik is een weerspiegeling van verminderde oxidatieve fosforylatie activiteit van de mitochondriën, hoewel alleen de NEFL-mutant cellen een zeer uitgesproken vermindering van de basale en maximale respiratie vertoonden.

De door Van Lent en collega's7 gepresenteerde gegevens onthullen dus afwijkingen in mitochondriaal transport, morfologie, genexpressiepatronen en zuurstofverbruik die gemeenschappelijk zijn voor meerdere vormen van axonale CMT, hetgeen suggereert dat mitochondriale disfunctie een gemeenschappelijk kenmerk kan zijn van axonale CMT. Hoewel dit werk aantoont hoe belangrijk mitochondriën zijn in CMT-pathogenese, blijven enkele belangrijke vragen onbeantwoord: Gaat het verlies van functie van de mitochondriën vooraf aan de vermindering van de mitochondriale mobiliteit, of treden ze tegelijkertijd op? Zijn beide kenmerken met elkaar verbonden of treden ze onafhankelijk van elkaar op? Vertonen alle mitochondriën in de cel een verminderde oxidatieve fosforylering? Is er een verschil tussen mitochondriën in het cellichaam en die in de axonen?

Ultrastructurele studies en mitochondriale kleuring in cellen kunnen sommige van deze vragen beantwoorden. In hun bespreking wijzen Van Lent et al.7 de mogelijkheid van selectief blokkeren van defecte individuele mitochondriën in axonen; een idee dat interessant zou zijn om na te streven in toekomstige studies. Het zou ook de moeite waard zijn om te bepalen welke mitochondriën de grootste veranderingen in vorm vertonen. Een TMRM- (tetramethylrhodamine) test in levende neuronen - die alleen mitochondriën kleurt met een intact membraanpotentiaal en dus intacte oxidatieve fosforylering - zou kunnen aantonen of de disfunctionele mitochondriën beperkt zijn tot het axon of gevonden worden in het hele neuron.

Het bestuderen van mitochondriën in neuronale progenitorcellen afgeleid van patiënt iPSC’s kan ook nieuwe inzichten verschaffen in de moleculaire mechanismen van perifere neuropathie. In sommige van de patiënten motorneuronen bestudeerd door Van Lent en collega's, was het zuurstofverbruik al verlaagd op dag 24-25. Het zou interessant zijn om uit te zoeken op welk punt tijdens de differentiatie mitochondriale defecten beginnen te verschijnen. In een recente publicatie over SURF1 cerebrale organoïden,8 bleek dat de mitochondriale defecten waargenomen in volwassen neuronen al duidelijk waren in het neuronale progenitor stadium. Aangezien neuronale progenitorcellen klein zijn en geen lange neurieten hebben, is de mitochondriale mobiliteit misschien niet belangrijk voor hun functie. Het zou echter de moeite waard zijn om te onderzoeken of neuronale progenitorcellen van CMT-patiënten ook afwijkingen vertonen in dit vroegere stadium.

Neuronen zijn post-mitotische cellen en hebben niet het vermogen zich te delen. Het relatief kleine cellichaam van het neuron moet het lange axon in stand houden met behulp van axonale transportmechanismen, waarbij mitochondriën, lysosomen/endosomen, eiwitten en RNA (granules) verplaatst van het cellichaam naar de axonterminal (anterograde transport) en van de axonterminals naar het cellichaam (retrograde transport). Dit kan verklaren waarom axonaal transport defecten een veel voorkomend ziekteverloop lijken te zijn in CMT, en waarom het aanpakken van axonaal transport gunstig kan zijn voor een breed scala van genetische vormen van CMT.

Nieuwe behandelingsmethoden zijn gericht op het verbeteren van axonaal transport met HDAC6-remmers door de tubulineacetylatie te herstellen.9 Van Lent en collega's7 testten een andere benadering, waarbij ze gebruikmaakten van een remmer van het leucine rits kinase (DLK) om stress-geïnduceerde transcriptie te moduleren die werden beïnvloed in de cellulaire modellen van CMT. DLK-inhibitor behandeling verbeterde de neuronale functie in MFN2 en NEFL gemuteerde sensorische en motorische neuronen, wat suggereert dat er gemeenschappelijke moleculaire doelen aanwezig zijn in beide neuronale types (Fig. 1). Dit illustreert de waarde van het gebruik van iPSC-afgeleide neuronen voor de ontwikkeling van behandelingen voor CMT.

Juliane S. Müller en Rita Horvath

Afdeling Klinische Neurowetenschappen, John Van Geest Centrum voor Hersen Herstel, School voor Klinische Geneeskunde, Universiteit van Cambridge, Cambridge, UK

Correspondentie naar: Rita Horvath

E-mail: rh732@medschl.cam.ac.uk

doi: 10.1093/brain/awab278

Fondsen

R.H. is een Wellcome Trust Investigator (109915/Z/15/Z), die ondersteuning ontvangt van the Medical Research Council (UK) (MR/N025431/1) en MR/V009346/1), the European Research Council (309548), the Newton Fund (UK/Turkey, MR/N027302/1), the Addenbrookes Charitable

Trust (G100142), the Evelyn Trust, the Stoneygate Trust, the Lily Foundation en een MRC strategische prijs om een Internationaal Centrum voor Genomische Geneeskunde in Neuromusculaire Aandoeningen (ICGNMD) MR/S005021/1. Dit onderzoek werd ondersteund door het NIHR Cambridge Biomedical Research Centre (BRC-1215-20014). De meningen die je kan lezen zijn die van de auteurs en niet noodzakelijk die van het NIHR of het Ministerie van Volksgezondheid en Sociale Zorg.

Concurrerende belangen

De auteurs melden geen tegenstrijdige belangen.

Referenties

1. Timmerman V, Strickland AV, Zu¨ chner S. Genetics of Charcot-Marie-Tooth (CMT) disease within the frame of the human genome project success. Genes (Basel) 2014;5(1):13–32.
2. Juneja M, Burns J, Saporta MA, Timmerman V. Challenges in modelling the Charcot-Marie-Tooth neuropathies for therapy development. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2019;90(1):58–67.
3. Saporta MA, Dang V, Volfson D, et al. Axonal Charcot-Marie-Tooth disease patient-derived motor neurons demonstrate disease-specific phenotypes including abnormal electrophysiological properties. Neurology. 2015;263:190 199.
4. Sainio MT, Ylikallio E, Ma¨enpa¨a¨ L, et al. Absence of NEFL in patientspecific neurons in early-onset Charcot-Marie-Tooth neuropathy. Neurol Genet. 2018;4(3):e244.
5. Manganelli F, Parisi S, Nolano M, et al. Insights into the pathogenesis of ATP1A1-related CMT disease using patient-specific iPSCs. J Peripher Nerv Syst. 2019;24(4):330–339.
6. Perez-Siles G, Cutrupi A, Ellis M, et al. Energy metabolism and mitochondrial defects in X-linked Charcot-Marie-Tooth (CMTX6) iPSC-derived motor neurons with the p.R158H PDK3 mutation. Sci Rep. 2020;10(1):9262.
7. Van Lent J, Verstraelen P, Asselbergh B, et al. Induced pluripotent stem cell-derived motor neurons of CMT type 2 patients reveal progressive mitochondrial dysfunction. Brain. 2021; awab226. doi:10.1093/brain/awab226
8. Inak G, Rybak-Wolf A, Lisowski P, et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nat Commun. 2021;12(1):1929.
9. Benoy V, Van Helleputte L, Prior R, et al. HDAC6 is a therapeutic target in mutant GARS-induced Charcot-Marie-Tooth disease. Brain. 2018;141(3):673–687.

• Fibroblasten => iPSC’s => motor!sche neuron,  motorische en sensorische neuronen, sensorische neuron
• Mitochondriale morfologie: verhoogde mitochondriale fragmentatie
• Neurietnetwerken: negatief effect op neurale uitgroei en netwerken
• Axonaal transport: langzamere beweging van mitochondriën (MitoTracker)
• Mitochondriale genexpressie (RNAseq): Veranderde metabolische signaturen op RNAseq
• OXPHOS, ATP productie (Seahorse): Verminderd zuurstofverbruik (Seahorse)
• Elektrofysiologie: Abnormale multi-electrode opstelling.